Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 28/06/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-696899)
48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie injecte un vecteur viral dans le cerveau pour bloquer une protéine des cellules gliales, puis les souris, logées seules, passent des tests d’anxiété en arène, de préférence alimentaire et un jeûne de 24 heures, afin d’étudier la régulation de la balance énergétique. Le porteur reconnaît que la récupération après chirurgie, l’isolement et le jeûne sont sources de douleur, de stress et de perte de poids. Il affirme qu’aucune méthode in vitro n’étudie le rôle de ces cellules gliales et renvoie au long terme d’éventuelles voies contre l’obésité.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et ses comorbidités représentent un grave problème de santé publique. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une région cérébrale appelée complexe vagal dorsal (CVD). Le CVD dispose de réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme, mais aussi de cellules gliales dont la contribution au contrôle de la balance énergétique commence à être révélée. Les cellules gliales sont équipées de protéines appelées connexines qui leur permettent d’envoyer des signaux aux neurones et d’établir une communication directe entre cellules gliales adjacentes. Nous utilisons des vecteurs viraux pour inhiber la fabrication des connexines spécifiquement dans les cellules gliales du CVD. Notre objectif global est d’évaluer le rôle joué par les connexines des cellules gliales du CVD dans le contrôle de la balance énergétique chez la souris. Les procédures décrites permettront de déterminer si les connexines des cellules gliales sont impliquées : 1) dans les préférences alimentaires des animaux ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales du tronc cérébral caudal régulent la balance énergétique chez le rongeur. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle des connexines 43 fortement exprimées par ces cellules gliales : 1) dans les choix alimentaires entre une nourriture standard et une nourriture enrichie en graisse et sucre ; 2) dans le contrôle fin de la prise alimentaire, de la prise hydrique, des dépenses énergétiques, ou encore de l’activité locomotrice ; 3) dans la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie morphinique et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un vecteur viral contrôle ou ciblant la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité et pour les mesures individuelles de prise alimentaire et la réponse au jeûne et à l’hyperphagie consécutive à un jeûne. Après récupération chirurgicale, un tiers des animaux subira un test comportemental, au cours duquel ils sont placés dans une arène pendant 30 minutes pour mesurer leur activité exploratoire et établir leur niveau d’anxiété. Une semaine après, un test de préférence alimentaire sur une durée de 8 jours sera employé. Les souris auront accès, à deux régimes différents : un régime standard et un régime enrichi en graisse et en sucre qui ne génère aucune douleur ou inconfort. A l’issue de ces régimes, soit à 6 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem. Après récupération chirurgicale, les autres animaux seront transitoirement hébergés dans des cages couplées à un système de calorimétrie indirecte pour étudier le métabolisme des animaux. Cet hébergement dure 3 jours, et aura lieu au cours de la 6e semaine post-chirurgie ou au cours de la 4e puis de la 7e semaine post-chirurgie. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. A la fin de la 9e semaine post-chirurgie, ces animaux sont utilisés dans un protocole visant à mesurer l’hyperphagie consécutive à un jeûne, les niveaux de signaux métaboliques en réponse au jeûne ou à la réalimentation, ainsi que la réponse neurale à ces modifications du statut nutritionnel. Ce protocole a lieu après une habituation de 3 jours, au cours de laquelle la nourriture est retirée de la cage pendant 2h afin de minimiser l’angoisse des animaux vis-à-vis du jeûne. Les souris du groupe contrôle sont mises à jeun pour une durée de 24h et les souris du groupe test sont mises à jeun pendant 21h et sont réalimentées pendant 3 heures. Après ces 24h, soit à 9 semaines post-chirurgie, les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie générale et le cerveau sera prélevé pour les analyses histologiques post-mortem.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire dans la suite des procédures. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après récupération postopératoire, l’hébergement de 3 jours dans les Physiocages nécessaires pour l’exploitation du système de calorimétrie indirecte est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. L’exposition aux régimes riches en graisse et en sucre ne génère aucune douleur ou inconfort mais la pesée toutes les 12 heures pourrait également constituer une nuisance. La récupération des cerveaux fixés, indispensable aux études immuno-histologiques post-mortem, nécessite une mise à mort par perfusion intracardiaque.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortem sont indispensables : 1) Pour vérifier l’expression du vecteur viral par les cellules gliales dans la région d’intérêt ; 2) et caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.
2. Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 48 souris mâles, réparties en 6 lots de 8 animaux. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Un précédent projet pilote nous a permis de vérifier l’efficacité de nos vecteurs viraux à réduire spécifiquement la fabrication des connexines des cellules gliales dans la zone cérébrale d’intérêt. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction. La procédure 1 mobilise deux lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les préférences alimentaires des souris. La mesure des préférences alimentaires entre un régime alimentaire standard et un régime riche en gras et en sucre nécessite un effectif de 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Deux lots d’animaux sont à comparer dans cette procédure, l’un ayant été traité avec le vecteur viral permettant de réduire la fabrication des connexines, et l’autre avec un vecteur viral contrôle. L’effectif de 8 animaux par lot est également compatible avec les autres mesures prévues dans cette procédure 1 (comportement exploratoire des animaux, qui donne une mesure du niveau d’anxiété) et analyse post-mortem du nombre de cellules gliales ayant incorporé les vecteurs viraux). La procédure 2 mobilise 4 lots de 8 animaux pour tester l’impact de la réduction des connexines sur les réponses à un jeûne ou la réintroduction de nourriture après un jeûne : 2 vecteurs viraux (contrôle et ciblant la fabrication des connexines) x 2 statuts nutritionnels différents (à jeun pendant 24h et à jeun pendant 21h puis réalimenté pendant 3h). Les mesures à effectuer nécessitent 8 animaux par lot compte tenu de la variabilité des mesures (mesure de la consommation alimentaire des animaux renourris ; mesure post-mortem sur le tissu cérébral analyse de la morphologie des cellules gliales, cartographie des neurones activés). Cet effectif par lot est compatible avec les mesures préalables prévue dans la procédure 2 (suivi de la consommation alimentaire et analyse du métabolisme énergétique par mesure de la consommation d’oxygène et de la production de dioxyde de carbone).
3. Raffinement
Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie des points limites et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique pré-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. La mise à mort sera réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Le recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non invasives, la mesure de plusieurs paramètres relatifs au métabolisme énergétique. Les mesures sont effectuées simultanément sur un même animal pour faciliter les études de corrélations entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests de réponse au jeûne, les animaux seront habitués à la manipulation et au retrait de la mangeoire (pendant 2h en phase diurne les trois jours précédant la mise à jeun de 24 h). Cette phase d’habituation a pour objectif de réduire l’angoisse animale, notamment causée par l’absence de nourriture en fond de cage et d’éviter, au cours de la phase de réalimentation, des fluctuations importantes de la prise alimentaire dû à la manipulation des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie d’injection intracérébral jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Les atlas stéréotaxiques se basent sur cet âge pour estimer les coordonnées stéréotaxiques des structures ciblées.