Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-241610)
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Cinq cents femelles sont superovulées par injections d’hormones pour produire un maximum d’ovocytes, puis tuées pour les prélever, et cent autres subissent une laparotomie de réimplantation d’embryons. Le porteur indique que les receveuses ne sont pas réutilisées car une seconde laparotomie serait plus douloureuse que la première. Il affirme que le recours à la souris est « essentiel » pour la biologie du développement, les cultures cellulaires ne reproduisant pas la vascularisation et le contexte tridimensionnel des organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
A l ‘heure ou on constate que l’incidence de la plupart des maladies dépend du sexe, il est paradoxal que certains gènes importants pour la détermination du sexe restent à identifier. Chez l’homme (et la souris), les mutations de certains gènes sont responsables d’anomalies du développement du système urogénital (rein et appareil génital). L’appareil génital comprend différents organes dont les gonades qui sont présentes chez l’embryon. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Les patients affectés ont des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe c’est-à-dire que l’appareil génital présente toutes les caractéristiques de l’appareil génital de garçon ou de fille quel que soit le sexe génétique de l’enfant. Pour comprendre le rôle des facteurs responsables du développement normal de la gonade (testicule chez le mâle et ovaire chez la femelle), nous devons reproduire les mutations de ces gènes chez la souris, ce qui nous permet d’étudier finement les conséquences pathologiques à différents stades. Ainsi notre projet permettra d’identifier les facteurs clés des premières étapes du développement de la gonade avec un intérêt particulier sur l’ovaire. Cela nous donnera un point d’entrée pour étudier les pathologies telles que l’insuffisance ovarienne précoce dont les symptômes sont le dérèglement ou l’absence de puberté, les problèmes de fertilité, les dérèglements hormonaux et les cancers de l’ovaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène qui est responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
500 femelles donneuses d’ovocytes achetées chez un fournisseur agréé seront superovulées par injection intrapéritonéale afin d’obtenir un nombre maximum d’ovocytes par femelle. Les ovocytes seront microinjectés. La réimplantation des embryons sera réalisée par intervention chirurgicale non dommageable. Cela concerne 100 femelles.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour la procédure 1 de superovulation, les nuisances en lien avec la superovulation est une douleur légère et brève liées aux injections intrapéritonéales d’hormones, les hormones n’induisent pas de douleur chez les femelles. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, les nuisances sont principalement la douleur liée à la laparotomie et à sa cicatrisation. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de l’intervention. Brièvement, des difficultés opératoires telles qu’une hémorragie supérieure à 0,5 ml, un temps d’intervention de plus de 30 mn ou post opératoire majeures (réveil retardé de plus de 15 mn, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) peuvent subvenir en de rares occasions.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de la procédure 1, les femelles donneuses seront euthanasiées afin de collecter leurs ovocytes. A l’issue de la procédure 2, les femelles receveuses ne seront pas réutilisées et euthanasiées car une deuxième laparotomie serait bien plus douloureuse que la première.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l’expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l’étude des causes des maladies de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d’appréhender le développement de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour l’utilisation d’un nombre minimal de souris. Nous avons besoin de femelles donneuses et receveuses et pour ne pas générer des males surnuméraires, nous commandons les femelles chez un fournisseur agréé ce qui permet d’obtenir que le sexe d ‘intérêt et de réduire le nombre de souris. Nous utilisons la super-ovulation des femelles donneuses qui permet de produire de 2 à 3 fois plus d’ovocytes par femelle, ce qui permet de réduire le nombre de femelles donneuses. Les femelles receveuses sont mises en accouplement avec des males stériles. Ainsi si la réimplantation des ovocytes n’a pas pu avoir lieu, ces femelles ne donnent pas de portées surnuméraires et peuvent être remises en croisement rapidement. Cela contribue à réduire le nombre d’animaux nouveau-nés. Les protocoles sont standardisés et nous avons déjà réalisés cette chirurgie permettant la réimplantation d’ovocytes. Ainsi notre rapidité d’exécution nous permet de réimplanter des embryons dans les deux cornes utérines de la souris et ainsi de réduire le nombre de souris receveuse par deux. Nous pouvons anticiper la fréquence d’obtention de certains paramètres tels que le sexe de la souris (nous étudions les femelles soit un animal sur 2) mais nous ne pouvons pas évaluer l’activité du transgène car elle dépend du site d’insertion dans le génome (qui est imprévisible) pour déterminer le nombre de souris à générer (ainsi nous anticipons de 3 à 8 réplicas pour un sexe donné). Cependant les micro-injections d’un transgène donné seront réalisées sur plusieurs jours avec un ou deux jours par semaine, ce qui nous permet d’analyser les résultats de façon échelonnée. Dès que le résultat est reproductible au moins 2 fois, nous arrêterons ces travaux ce qui réduira le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Pour la procédure 1 de superovulation, aucune aggravation résultant directement du traitement n’est attendue. Les animaux sont néanmoins surveillés afin de déceler tout signe de souffrance ou de blessure à l’issue d’accident ou bagarre afin de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. Pour la procédure 2 de réimplantation d’embryons, pendant et après la chirurgie, l’anesthésie au gaz isoflurane et l’administration d’antalgiques permet de limiter au maximum les douleurs engendrées. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Ce protocole inclue la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés permettant de mettre un terme aux souffrances des animaux le cas échéant. De plus, les souris seront hébergées par deux ou par trois dans des cages comportant des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d’exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier chez la souris, l’impact de copies de gènes contenant les mutations responsables de maladies. Nous utiliserons des femelles adultes âgées de 3 à 4 semaines pour les superovulations ou âgées de plus de 6 semaines car c’est l’âge optimum pour la superovulation (avant la mise en place des cycles ovariens ou après leur stabilisation) et 6 à 20 semaines pour les pseudo-gestantes.