Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-01-16 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-807371)
132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un traitement in utero de la maladie de Menkès. Les femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept, et les souriceaux mâles malades subissent sept tests neurocomportementaux de J3 à J38. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux non traités et un risque de mort par anévrisme aortique, précédé de perte de poids et d’apathie. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles à J38, tandis que quarante femelles sont gardées vivantes pour de futurs accouplements.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Menkes est une maladie genetique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un deficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacite du cuivre a franchir les barrieres biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extremement pauvre avec des troubles graves aboutissant a un deces dans les premieres annees de vie. Les nanoparticules ont la capacite de franchir differentes barrieres biologiques dont la barriere placentaire. Nous suivons une piste therapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthetique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montre une tolerance des souriceaux à ce traitement. Nous avons determine une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et demontre l’amelioration des signes cliniques chez les souriceaux males malades traites par TSC. Neanmoins, malgre un allongement tres net de l’esperance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrige les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne demarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux males non traites montrent une forte mortalite a la naissance avec des ratio sexe/genotype non respectes. Les atteintes liees au deficit en cuivre apparaissent des le stade embryonnaire. Notre projet vise a montrer qu’un traitement precoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes – Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas – Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie – Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
1) Une mortalite importante a la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitees pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traites ou traites par histidine-cuivre liee au risque d’anevrisme aortique. Ce point est previsible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une febrilite (troubles de la mobilite, difficultes d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et a la naissance (construction du nid, gestion de la portee…) grâce au traitement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
2. Réduction
L’etude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise a mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sangcerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinees a l’etude de l’impact du traitement gestationnel sur la descendance male. L’etude comportementale, quant a elle, portera sur 40 souris reparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront etudiés et mis a mort une fois les tests comportementaux termines, a l’age de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d’animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l’étude, un nombre d’animaux necessaire pour mener a bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.
3. Raffinement
Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procedure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : differents elements visuels chez l’animal sont evalues afin d’etablir un score qui permet d’anticiper et d’eviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermes, dos voute, poils herisses, immobilite, perte de poids, yeux et abdomen creux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L’utilisation d’un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d’étudier l’efficacité du médicament dans l’intégralité d’un organisme vivant proche de l’homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l’étude d’autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l’âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.