Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-01-19 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-308834)
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique créant une lésion cérébrale, un test comportemental du cylindre, puis des injections quotidiennes de lévodopa pendant trois à quatre semaines qui provoquent des mouvements involontaires. Le porteur décrit ces dyskinésies, rotations, mouvements excessifs des pattes et de la langue, toilettage excessif, ainsi qu’une perte de poids et de poils. Il justifie le modèle par l’impossibilité de reproduire in vitro la complexité du réseau neuronal en jeu.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Parkinson est causée par la mort progressive des neurones dopaminergiques, qui se manifeste par des tremblements et la perte progressive de la mobilité du patient. Le traitement le plus courant consiste à administrer un précurseur de la dopamine, la lévodopa (L-DOPA), qui compense dans un premier temps le manque de dopamine. Malheureusement, au fil des années de traitement, l’administration de la lévodopa, nécessaire au patient pour son activité motrice, déclenche également des mouvements involontaires (dyskinésies). Ces dyskinésies s’amplifient progressivement au point d’amener à l’arrêt du traitement. Des études récentes sur des modèles animaux ont permis de mieux comprendre comment la répétition du traitement lévodopa génère ces dyskinésies. Ces travaux indiquent que, au fil du traitement, certains neurones développent une hypersensibilité à la levodopa, qui est directement la cause des dyskinésies. Nous proposons une nouvelle approche pour modérer la réponse neuronale à la dopamine en modifiant l’action d’une enzyme, ce qui pourrait prévenir les dyskinésies chez les patients. L’objectif de ce projet est d’établir la preuve de concept de cette nouvelle stratégie thérapeutique, et comporte deux volets. D’une part, nous validerons le mécanisme d’action thérapeutique sur des préparations de neurones in vitro ; d’autre part, nous testerons l’effet thérapeutique in vivo. Ces deux volets seront réalisés à partir de souris parkinsoniennes, traitées par la lévodopa pour l’induction de dyskinésies. L’effet thérapeutique sera validé in vivo en administrant des activateurs ou inhibiteurs de l’enzyme ciblée, et en mesurant l’effet de ces molécules sur la production de dyskinésies chez la souris. L’imagerie de biosenseurs permet de mesurer in vitro la réponse des neurones à la dopamine. Nous mesurerons avec cette méthode, sur des neurones provenant des mêmes animaux, l’efficacité des molécules thérapeutiques pour réduire la réponse à la dopamine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Alors que l’administration de lévodopa plusieurs fois par jour reste la thérapie la plus courante, il reste malheureusement peu d’option thérapeutique lorsqu’un patient parkinsonien développe des dyskinésies trop invalidantes. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques apparaît donc comme un impératif de santé publique. Sur la base d’études fondamentales d’une part, et de données obtenues sur des modèles animaux de la maladie, nous mettons en avant une hypothèse tout à fait originale pour modérer la réponse neuronale excessive à la dopamine qui survient lors de l’administration de lévodopa, et qui est la cause des dyskinésies. Ce projet vise à tester cette hypothèse in vitro et in vivo : si elle se vérifie, notre travail apportera des arguments solides qui motiveront le lancement de nouvelles recherches pharmacologiques pour développer de nouveaux médicaments. Si notre hypothèse est invalidée, cela forcera à reconsidérer nos connaissances dans ce domaine et à affiner nos modèles théoriques, ce qui pourra alors orienter les recherches vers d’autres cibles thérapeutiques. Par ailleurs, la partie imagerie in vitro de notre étude apportera des données tout à fait nouvelles quant à la réponse à la dopamine dans les neurones provenant de souris parkinsoniennes. Ce nouveau jeu de données, avec une précision spatiale et temporelle encore jamais atteinte, amènera des nouvelles connaissances sur les changements subis par les neurones au cours des différentes phases de la maladie de Parkinson et de son traitement par la lévodopa. Enfin, ces mesures seront extrêmement utiles pour établir des modèles numériques de neurones, ce qui permettra d’avancer dans la direction d’études physiologiques «in silico».
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux seront impliqués dans les actes suivants : – une chirurgie stéréotaxique afin d’induire le modèle hémi-parkinsonien ; effectué sous anesthésie/analgésie (1h). – 3 semaines après la chirurgie : l’étendue de la lésion est évaluée par le test comportemental du cylindre réalisé 1 fois pendant 3 minutes (l’animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes et un expérimentateur compte le nombre de fois où l’animal touche la paroi du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche) – Traitement quotidien sur animal vigile pendant 3 à 4 semaines par injection intra-péritonéale, avec ou sans les molécules pharmacologiques à tester (quelques secondes par souris) – Une euthanasie en vue des différents prélèvement et analyses sous anesthésie Une partie des animaux subira une étape supplémentaire juste avant l’euthanasie : – une deuxième chirurgie sous anesthésie/analgésie (1h20) pour injecter un virus nécessaire pour de l’imagerie de biosenseurs. L’animal est euthanasié le lendemain.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans l’hémisphère droit. Des symptômes moteurs sont visibles dans les jours suivant la chirurgie, ce qui se manifeste par une activité motrice amoindrie, associée à une perte de poids. L’hémisphère cérébral gauche non lésé compense progressivement et après une à deux semaines, seuls des tests spécifiques peuvent révéler l’existence de la lésion. Le traitement répété par la lévodopa induit progressivement l’apparition de dyskinésies. Celles-ci peuvent apparaître entre 10 min et 3 h après injection de la lévodopa. La lésion étant effectuée à droite, les mouvements anormaux se produisent uniquement du côté opposé à la lésion. Ces mouvement anormaux apparaissent sous diverses formes : rotation à gauche, rotation du buste de l’animal vers la gauche, mouvement excessif des pattes, sortie excessive de la langue, toilettage excessif. Ce traitement quotidien peut mener chez certains animaux à une faible perte de poids ainsi qu’une perte de poils au niveau du flanc gauche suite aux mouvements et toilettages répétés à gauche.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’objectif étant d’effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l’issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet vise à analyser les mécanismes neuronaux à l’origine des dyskinésies induites par le traitement à la lévodopa, et à tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour limiter ces mouvements involontaires. L’effet de la lévodopa et le développement des dyskinésies impliquent de nombreuses adaptations au sein d’un réseau de neurones impliquant diverses régions du cerveau. Il est à notre connaissance impossible de reproduire la complexité des effets du lévodopa sur des cultures de neurones. Les études par modélisation «in silico» ne sont pas non plus possibles pour étudier les dyskinésies induites par la lévodopa car le fonctionnement de neurones n’est pas encore connu avec suffisamment de précision pour pouvoir développer des modèles numériques fiables. Un des objectifs de notre projet est justement de produire des données qui permettront ensuite de concevoir des modèles numériques plus fiables et représentatifs de la maladie. Enfin, ni des observations sur cultures cellulaires, ni des modélisations numériques, ne prédisent avec une fiabilité suffisante l’efficacité éventuelle d’un traitement pour des patients. Pour que la nouvelle stratégie thérapeutique que nous suggérons puisse déclencher des recherches pharmaceutiques ultérieures, il est indispensable de démontrer cet effet dans une situation expérimentale qui reproduit les aspects critiques du phénomène, ce qui, à ce jour, ne peut être obtenu que dans un modèle animal. C’est pourquoi nous proposons d’utiliser des souris avec une lésion d’un seul hémisphère, une situation dans laquelle cette moitié lésée du cerveau reproduit de nombreux aspects des dyskinésies induites par la lévodopa.
2. Réduction
Les souris seront utilisées pour l’étude comportementale in vivo ainsi que pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Cette double utilisation permet de valoriser au mieux les animaux utilisés dans ce projet. De plus, pour l’étude mécanistique, nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs est établie grâce à un calcul de puissance et permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera un total de 320 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires. Ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.
3. Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie adaptée avec nourriture et eau à volonté, matériel pour édifier le nid. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. La lésion des neurones dopaminergiques est réalisée uniquement dans un hémisphère du cerveau ce qui induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, l’animal est pesé et reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. Pendant toute la durée de récupération, l’animal est placé sur un tapis chauffant et une nourriture enrichie est à sa disposition. Au delà des trois premiers jours, le poids de l’animal et la présence de signe de douleur sont évalués. Des points limités sont définis au préalable et un suivi quotidien permet de garantir le bien être des animaux. Dans le cas contraire, des mesures sont mises en œuvre pour y remédier (utilisation d’analgésique, d’anti-inflammatoire non stéroïdien ou euthanasie).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Notre projet doit faire appel à un modèle animal qui représente avec un maximum de fidélité les aspects de la maladie de Parkinson que nous souhaitons étudier. En particulier, notre modèle doit reproduire les dyskinésies produites par l’administration de L-DOPA, ce qui est le cas avec le modèle murin hémiparkinsonien. Ce modèle animal présente une lésion d’un seul côté du cerveau, ce qui minimise les dommages infligés à l’animal. De plus, les symptômes parkinsoniens et dyskinésies sont obtenus sur un laps de temps de quelques semaines, ce qui est court par-rapport à d’autres modèles de maladie de Parkinson : la durée des procédures est donc réduite. Ce modèle animal est bien décrit pour des souris mâles de 8 à 12 semaines au début du protocole, ce qui détermine notre choix.