Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-01-19 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-405642)
1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d’un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu’aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c’est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme « très encourageants » et défend une molécule sous brevet.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l’animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d’un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d’action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d’habituation et à l’anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l’utilisation de logiciels statistiques nous permet d’anticiper le nombre optimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l’administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d’envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l’industrialisation de ce traitement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l’oeil pendant 7 jours d’un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d’évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l’échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d’animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d’intervalle entre chaque série de tests).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l’homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d’intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l’inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d’établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l’âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d’intérêt, de déterminer sa structure et son mode d’action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l’administration de cette molécule dans l’oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu’elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l’oeil.
2. Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l’obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d’administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d’évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l’effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l’effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l’étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l’analyse de 2 applications et le nombre d’animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.
3. Raffinement
Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l’intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d’habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l’aspect de l’oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l’animal (démangeaisons…) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l’utilisation de l’imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d’animaux mais de diminuer leur manipulation car c’est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l’efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.