Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-512355)
84 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d’injection intracérébrale sous anesthésie, un régime enrichi en graisses et en sucre pendant dix-sept à vingt-neuf semaines, puis des tests métaboliques avec mise à jeun de quatorze heures, gavage de glucose et sept prélèvements de sang à la queue. Le porteur cible la connexine 43 de cellules gliales pour comprendre la régulation de l’appétit, et renvoie les retombées contre l’obésité au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu’aucune méthode in vitro ne permet d’étudier ces cellules gliales et conclut au recours à la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication entre cellules gliales et entre neurones et cellules gliales. Ce projet permettra d’étudier le rôle fonctionnel joué par la connexine 43 dans un contexte d’alimentation enrichie en graisses et en sucres. La moitié des animaux (nourris sous un régime standard ou hypercalorique) auront l’expression de la connexine 43 réduite pendant le développement de l’obésité pour tester la propension des animaux à prendre du poids sous régime enrichi en graisses et en sucre. L’autre moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite alors que l’obésité est déjà installée pour déterminer si la communication des cellules gliales par les connexines 43 modifie le contrôle de prise alimentaire, la glycémie ou le poids corporel chez des souris obèses.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales : 1) dans la propension des animaux à développer une obésité lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre, 2) dans le contrôle de prise alimentaire ou du poids corporel lors d’une obésité déjà installée. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
A partir de 5 semaines d’âge, la moitié des animaux est alimentée avec un régime enrichi en graisse et en sucre, et ce, jusqu’à la fin des procédures (pendant 17 semaines pour la procédure 1 et 29 semaines pour procédure 2). Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Les animaux subiront un (procédure 1) ou deux (procédure 2) test(s) métaboliques (4 h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4 h, moins d’1 min par prélèvement). Ces tests nécessitent une mise à jeun préalable de 14 h. A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort pour les analyses histologiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du métabolisme et de la glycémie. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse ne génère aucune douleur ou inconfort, mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. L’administration orale de glucose cause un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortems sont indispensables : 1) Pour vérifier que la région d’intérêt a correctement été ciblée; 2) et caractériser les réponses cellulaires gliales. Dans la procédure 2, les animaux « résistants » à l’obésité induite par l’alimentation, c’est-à-dire nourris avec le régime enrichi en graisses et en sucre et qui n’auraient pas eu un gain de poids supérieur ou égal à 130 % à la prise de poids moyenne de la cohorte contrôle sont mis à mort. Ces mises à mort sont réalisées avant les injections intra-cérébrale pour éviter de générer de l’inconfort chez des animaux qui ne pourront pas être utilisés dans nos expériences. Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.
2. Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 84 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Nos résultats préliminaires ont vérifié une altération de l’expression de la connexine 43 de la 3e à la 10e semaine post-chirurgie. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique pour vérifier l’efficacité de nos injections intra-cérébrales, et pour observer le nombre et de la morphologie des cellules gliales dans notre modèle. Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour chaque procédure : Présence ou absence de connexine 43 (des animaux recevront le composé qui permet de réduire l’expression de la connexine 43 et les autres animaux recevront un composé inactif) x 2 conditions différentes de régime alimentaire, soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, une analyse des données de la littérature indique que la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7 – 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections. Néanmoins, nous devons également prendre en compte le pourcentage d’échec, pouvant aller jusqu’à 30 %, pour induire une obésité chez la souris. Un effectif de 13 animaux par lots d’animaux soumis au régime hypercalorique est nécessaire. Ces effectifs par lot sont pleinement compatibles avec les tests métaboliques qui mobilisent 4 lots d’animaux chacuns (2 variables par expérience : composé ciblant ou non la Cx43 x 2 régimes alimentaires.
3. Raffinement
Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie préopératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. La mise à mort est réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests métaboliques. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2 h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) contribuera à diminuer le stress des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour les mesures individuelles de prise alimentaires et les tests métaboliques. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissement plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines parmi : dôme en carton, tunnel en polycarbonate rouge, bûchette en bois, tunnel en carton, cylindre de coton.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes obésogènes peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.