Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-768667)
242 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. La plupart développent une insuffisance rénale chronique provoquée par un régime enrichi en adénine, reçoivent la ladarixine ou un placebo par gavage cinq jours sur sept, subissent des anesthésies gazeuses répétées et des prises de sang, avant une ponction terminale de tout leur volume sanguin dans l’aorte. Le porteur prévient que l’adénine peut causer une insuffisance rénale très sévère, avec perte de poids, prostration et surmortalité, et restreint les rats témoins à 75 % de leur ration pour les besoins de l’imagerie. Il teste la ladarixine contre les calcifications cardiovasculaires et affirme ces phénomènes « non modélisables in vitro ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) résulte d’une dégénérescence fibro-calcique de la valve aortique à l’origine de désordres hémodynamiques responsables de complications cardiovasculaires majeures. A ce jour, il n’existe aucun traitement capable de réduire la progression du RAC. Le remplacement de la valve altérée reste aujourd’hui la seule option thérapeutique efficace. Chez les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique (IRC), ce remodelage pathologique de la valve est plus fréquent, plus précoce, et progresse plus rapidement, entraînant une mortalité trois fois plus importante qu’en population générale. Dans cette population, le remplacement valvulaire est associé à une mortalité plus importante. Une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant au développement du RAC chez ces patients apparaît donc cruciale afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques sur lesquelles agir afin de ralentir son évolution. Il a été démontré que l’interleukine 8 (IL-8), dont les concentrations sanguines sont élevées chez les patients IRC, favorise in vitro la calcification des cellules de la valve aortique et de l’aorte. Ces travaux suggèrent que l’IL-8 pourrait jouer un rôle clé dans l’évolution rapide de la pathologie dans un contexte d’IRC. Le travail que nous proposons ici vise à vérifier dans un modèle animal d’IRC si l’antagonisme des récepteurs de l’IL-8 (appelés CXCR1 et CXCR2) permet de prévenir le développement du RAC. Notre objectif est de créer une méthodologie d’étude se rapprochant le plus possible de la réalité clinique, afin d’augmenter le potentiel translationnel de nos travaux, en répondant aux critères suivants : 1/ Établir un modèle d’insuffisance rénale progressive associée au développement de calcifications cardiovasculaires chez le rat, 2/ Utiliser un antagoniste pharmacologique de CXCR1 et 2 actuellement en cours d’évaluation clinique (la ladarixine) et 3/ Évaluer les conséquences de ce traitement sur les fonctions valvulaires et cardiaques des rats au moyen d’outils généralement utilisés en routine clinique (microCT, IRM, échocardiographie).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude permettra de vérifier si l’antagoniste des recepteurs de l’IL-8, appelé la ladarixine, peut être utilisé pour prévenir efficacement le développement des calcifications cardiovasculaires ainsi que les dysfonctions valvulaires et cardiaques se développant dans un contexte d’insuffisance rénale chronique chez le rat. L’obtention de résultats concluants in vivo pourrait mener à terme à une évaluation de l’usage en clinique de la ladarixine chez les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique. Pour rappel, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement médicamenteux efficace pour prévenir ou ralentir la progression des calcifications valvulaires/vasculaires. L’identification d’une approche pharmacologique permettant de prévenir la survenue ou de ralentir la progression du rétrécissement aortique calcifié permettra à terme à une meilleure prise en charge des patients et une diminution du coût pour la société.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une cohorte de 12 rats subira une à trois anesthésies gazeuses de 2h réalisées chacune à une semaine d’intervalle en vue de mettre au point les techniques d’imagerie IRM et d’échocardiographie. Une cohorte de 14 rats subira deux anesthésies gazeuses de 45 minutes réalisées à 2 jours d’intervalle afin comparer les données mesurées par IRM et par échocardiographie. Une cohorte de 36 rats sera soumise à un régime enrichi en adénine et en phosphate sur une durée pouvant aller de 5 à 12 semaines dans le but de mettre en place un modèle d’insuffisance rénale chronique associée au développement de calcifications cardiovasculaires. Une cohorte de 180 rats sera utilisée pour vérifier l’impact de la ladarixine sur le développement des calcifications cardiovasculaires secondaires à l’insuffisance rénale chronique. Les 180 animaux de cette cohorte seront maintenus sous régime contrôle (n=84) ou sous un régime adénine provoquant l’IRC (n=96) et recevront la ladarixine (n=90) ou le placebo (n=90), administrée par gavage 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg), durant toute la durée du régime. Au total, 216 animaux subiront deux anesthésies gazeuses de 45 minutes en début, en milieu et en fin de protocole afin d’évaluer l’impact des traitements sur les fonctions cardiaques et vasculaires par imagerie. Ces 216 animaux subiront deux prélèvements de 1 mL de sang, réalisés sous anesthésie générale, au début et au milieu du protocole. Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et leur volume sanguin total sera prélevé. Une chirurgie sera nécessaire au moment de l’euthanasie afin de pouvoir réaliser la ponction sanguine terminale. Cette procédure n’excèdera pas 5 minutes. Les analyses sanguines et tissulaires (aortes, valves, reins, os) permettront de conclure fermement sur les effets de la ladarixine sur le système cardiovasculaire dans ce modèle.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les rats des groupes IRC (n=114) développeront progressivement une insuffisance rénale chronique associée à des désordres cardiovasculaires. Ils devraient prendre moins de poids que les rats contrôles (n=102). Il se pourrait que la quantité d’adénine à laquelle seront exposés les animaux des cohortes IRC de l’étude pilote (n=18) provoque des IRC très sévères. Dans ce cas, les rats des groupes IRC pourraient montrer une perte de poids importante, une réduction du comportement exploratoire, des signes de prostration et un risque accru de mortalité en comparaison aux rats des groupes contrôles. L’ajout d’adénine modifie le goût des croquettes et peut provoquer une aversion des animaux envers l’aliment. Les rats des groupes contrôles (n=102) recevront un apport alimentaire correspondant à 75% de leur apport journalier sur toute la durée du protocole afin de ralentir leur prise de poids en vue de leur passage dans les appareils d’IRM et de microCT en fin d’étude. Une partie des rats (n=216) subira un prélèvement sanguin (au niveau de la veine de la langue ou de celle de la queue). Le prélèvement de sang au niveau de la veine de la langue pourrait être associé à l’apparition d’hématomes sublinguaux. Certains animaux (n=180) subiront un gavage journalier 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg). Tous les rats du protocole (n=242) seront soumis à plusieurs cycles d’anesthésies gazeuses d’une durée pouvant aller de 45 minutes à deux heures. Les rats ayant subi une anesthésie gazeuse pourraient souffrir de déshydratation. En fin de protocole 216 rats subiront une chirurgie sous anesthésie générale en vue de prélever la totalité de leur volume sanguin par ponction dans l’aorte abdominale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et la totalité de leur volume sanguin sera prélevé pour permettre à l’équipe de récupérer assez de sang pour la réalisation des analyses biochimiques et hématologiques nécessaires à l’interprétation des résultats. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal seront récupérées post-mortem pour analyses histologiques et quantification de l’expression des principaux marqueurs de calcification (expression protéique et des ARNm).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les études menées in vitro suggèrent que l’Interleukin 8 pourrait être l’un des éléments clés favorisant le développement des calcifications vasculaires et valvulaires dans l’insuffisance rénale chronique. In vitro, l’antagonisme des recepteurs de l’IL-8, appelés CXCR1 et CXCR2, inhibe les effets procalcifiants de l’IL-8. La présente étude vise à vérifier si l’usage de l’antagoniste des recepteurs de l’IL-8 (la ladarixine) permet de prévenir les dysfonctions valvulaires et cardiovasculaires survenant chez le rat atteint d’insuffisance rénale chronique. Ces phénomènes complexes (modification de la surface de l’orifice valvulaire, de la dimension de la valve, de l’épaisseur et de l’expansion de la paroi de la racine aortique, modulation du flux transvalvulaire aortique, du débit cardiaque, de la vitesse de l’onde de pouls, des dimensions et fonctions systoliques et diastoliques du ventricule gauche) qui apparaissent suite au développement des calcifications, ne sont pas modélisables in vitro et leur évaluation chez l’animal est un prérequis à une éventuelle utilisation de l’antagoniste chez l’homme.
2. Réduction
Le calcul du nombre d’animaux nécessaire a été effectué en tenant compte du pourcentage de décès lié à l’administration du régime provoquant l’insuffisance rénale chronique et du fait qu’il nous faudra en moyenne 12 animaux par groupe afin de réaliser des statistiques robustes nous permettant de conclure fermement sur notre hypothèse. Nous avons opté pour la mise en place d’une étude pilote « à tiroir » visant à déterminer à partir de petites cohortes la composition optimale du régime à administrer pour induire une insuffisance rénale chronique et des calcifications cardiovasculaires. Ceci permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour les mises au points. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal utilisé pour les mises au point des procédures d’imagerie seront récupérées post-mortem pour faire des mises au point d’histologie et de biologie moléculaire, ce qui évitera de commander des animaux de nécropsie spécifiquement à cet effet. Les fonctions valvulaires, vasculaires et cardiaques ainsi que le développement des calcifications cardiovasculaires seront évalués au moment de l’entrée des animaux dans le protocole, en milieu de protocole et avant l’euthanasie des animaux grâce à des techniques d’imagerie non-invasives. Cette approche longitudinale permettra d’obtenir un niveau élevé d’informations à partir du même animal, et de réduire le nombre d’animaux puisque le suivi morphologique du cœur, de la valve et de l’aorte ne nécessitera pas l’euthanasie. En fin d’étude, ces organes pourront être utilisés pour d’autres analyses (histologie, expression protéique et des ANRm). L’application sur un même animal de trois approches d’imagerie non invasives permet de réduire par 3 le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Cette approche permettra aussi de minimiser l’impact de l’hétérogénéité inter-individus au sein d’un même groupe et d’observer de manière longitudinale l’évolution de la pathologie. Pour éviter tout double emploi injustifié des animaux, une partie des os des rats de ce protocole seront récupérés post-mortem et utilisés dans le cadre d’une autre étude.
3. Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours sera mise en place à l’arrivée des rats. Les conditions d’élevages seront optimisées afin d’offrir aux rats un maximum d’éléments environnementaux leur permettant de reproduire leurs comportements naturels (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en carton pour se cacher, et des bûchettes). Les animaux âgés de 8 semaines et pesant environ 350g lors de leur entrée dans le protocole seront hébergés par 2 dans des cages standards (900 cm2). Si leur poids venait à dépasser 600g en cours d’étude, chaque duo sera hébergé en cage de 1800 cm2. Les animaux feront l’objet d’un handling journalier. Les animaux soumis au régime provoquant l’insuffisance rénale feront l’objet d’un suivi quotidien sur toute la durée du protocole grâce à une grille de scoring de la douleur adaptée. Si une souffrance associée au régime est détectée, des périodes de discontinuations seront envisagées (aliment donné 4 jours par semaine en alternance avec des phases de récupération de 3 jours durant lesquelles les rats seront nourris avec l’aliment standard). Nous avons choisi d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin d’évaluer de façon longitudinale la calcification du système cardiovasculaire ainsi que la morphologie du cœur et de la valve plutôt que d’euthanasier des animaux pour l’étude ex-vivo de chacun de ces paramètres. Cette approche nous a permis de réduire par 3 le nombre d’animaux necessaires à l’étude. Concernant la ladarixine, les données publiées dans divers modèles de souris et rats ainsi que les données obtenues lors des phases I et II du développement clinique de la molécule sont en faveur d’une très bonne tolérance.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle invertébré permettant de reproduire le syndrome le développement des calcifications vasculaires et valvulaires secondaires au développement d’une insuffisance rénale chronique, c’est pourquoi nous nous sommes orientés vers le rongeur. Chez le rongeur, le modèle rat est idéal car la valve aortique est de calibre suffisant pour la réalisation d’analyses d’expression protéiques et d’ARN, contrairement au modèle souris (valve aortique trop petite). Le modèle alimentaire choisi est usuellement utilisé chez des rats mâles âgés de 8 semaines lors de leur entrée dans le protocole. C’est pourquoi nous avons choisi de travailler sur des rats mâles à ce stade de développement.