Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 27/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-839253)
16 macaques a longue queue femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l’issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal enchaine IRM, scanner et imagerie TEP sous anesthesie generale, plusieurs seances de neurostimulation par ultrasons en chaise de contention, puis un test de memoire ou l’animal doit choisir entre deux gobelets pour obtenir une friandise, avant d’etre tue par surdosage d’anesthesique pour analyser son cerveau. Le porteur decrit un stress a l’induction de l’anesthesie, des douleurs aux sites d’injection et une gene liee a l’intubation et a la contention. Il affirme que les modeles in silico et in vitro ne reproduisent pas la physiologie cerebrale, juge l’usage du singe « indispensable » en vue d’une transposition a l’homme, et prevoit de reutiliser des femelles deja presentes dans l’etablissement.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Actuellement de nombreux protocoles thérapeutiques visant les troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression, …) sont confrontés à l’apparition de pharmacorésistance chez de nombreux patients. Il semble essentiel de trouver des solutions innovantes pour parer à ces complications. Plusieurs techniques de neurostimulations sont proposées: la neurostimulation magnétique transcrânienne, utilisée en clinique, est non-invasive mais a une mauvaise discrimination spatiale, et la stimulation cérébrale profonde qui offre une meilleure résolution spatiale mais nécessite une chirurgie lourde. Nous proposons de pallier ces défauts et de garder ces points forts en utilisant la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés. La neurostimulation ultrasonore (US) se fera par application d’une sonde US sur le crâne, permettant la propagation intracrânienne d’ondes US focalisées et la stimulation précise de régions cérébrales. Nos résultats actuels ont montré que la stimulation US induit une activation neuronale, un mécanisme capital dans la thérapeutique des troubles neuropsychiatriques. Cette technique de neurostimulation offrirait une alternative ciblée et non-invasive pour les troubles neuropsychiatriques. Des études exploratoires chez les rongeurs ont démontré la faisabilité de cette technique. Cependant, leurs physiologies (épaisseur du crâne, orientation et forme du cerveau) freinent la transposition en clinique humaine. Des simulations numériques et expérimentales ont montré que les ultrasons pénètrent de façon similaire la boite crânienne chez l’homme et chez le primate. Des manipulations sur des singes cynomolgus sont en cours sans anesthésie pour la neurostimulation. Mais il y a des difficultés lors de la stimulation malgré l’habituation (tête non immobile). Dans la continuité de ce protocole, ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore aigüe et chronique sur le primate non humain (PNH) anesthésié. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation US aigüe (n=8) et la neurostimulation US chronique (n=8). Ce nombre est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Tous les individus seront euthanasiés à la fin du projet par une méthode réglementaire et les cerveaux seront prélevés pour évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation US (neuroinflammation, neurotransmission, mort cellulaire, microhémorragies, …).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Actuellement, les cas de dépression chez l’homme sont traités à l’aide de divers protocoles thérapeutiques tels que la psychothérapie, les antidépresseurs et autres molécules pharmacologiques. Dans de nombreux cas, les patients développent une pharmacorésistance aux traitements médicamenteux. Cette pharmacorésistance nécessite l’orientation des patients vers d’autres techniques thérapeutiques. Parmi ces techniques, nous pouvons relever la méthode de neurostimulation magnétique transcrânienne ou la stimulation cérébrale profonde (stimulation par implantation d’électrode dans le cerveau) mais la première ne cible pas correctement la zone cérébrale impliquée dans la dépression et la deuxième est trop invasive. Pour pallier ces défauts, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité d’une nouvelle méthode non invasive et ciblée : la neurostimulation ultrasonore chez le singe. Ce projet permettra ainsi de progresser dans la possibilité de traduire cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques. La perspective directe de ce projet est une transposition de cette technique pour un essai clinique chez l’Homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. Sont concernés tous les animaux (n=16) IRM cérébrale sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. Scanner CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. Adaptation du dispositif de neurostimulation : Sont concernés tous les animaux (n=16), jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min – 1 mois minimum Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16). Cette imagerie sera réalisée 2 fois sur 8 animaux et 3 fois sur 8 autres animaux; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique: Sont concernés tous les animaux (n=16), 8 animaux avec 2 séances de stimulation et 8 animaux avec 10 séances de stimulation; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation. Test de comportement et de mémorisation : Sont concernés uniquement les animaux ayant une neurostimulation US chronique (n=8); pour la mémorisation, l’animal est placé dans un sas et devra choisir entre deux gobelets pour trouver une récompense (friandise). Euthanasie : Sont concernés tous les animaux (n=16), surdosage d’anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : – Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). – Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. – Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. – Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. – Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. – Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore. Concernant l’application des ondes ultrasonores lors de la neurostimulation et d’après nos précédentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable. Les ondes ultrasonores auront une fréquence au-delà de celle de la gamme audible des primates, il n’y aura donc pas d’effets indésirable escomptés. Ceci a été validé chez les rongeurs dans nos études précédentes et dans la littérature.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issu des 2 procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques des cerveaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les modèles in silico, in vitro, (cellulaires) et/ou mathématiques ne permettent pas de reproduire la physiologie cérébrale et son environnement (vascularisation, perfusion, débit sanguin, etc…), l’utilisation d’animaux est donc indispensable. De plus, l’objectif final est de transposer cette technique en clinique humaine, en conséquence les études chez l’animal ne peuvent pas être substituées. Des études précédentes ont été menées sur les rongeurs (souris et rats). Les résultats obtenus sont encourageants mais ils ne permettent pas une transposition directe de la neurostimulation en clinique humaine, notamment à cause des différences physio-morphologiques des rongeurs avec l’homme. Pour pallier ces différences, nous proposons d’évaluer notre méthode sur un modèle animal plus proche de l’homme pour la morphologie cérébrale et crânienne, le singe cynomolgus.
2. Réduction
Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. La réduction du nombre d’animaux se fera aussi par l’utilisation d’imagerie préclinique. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en volière disposant de plateformes surélevées avec les congénères et en présence d’objets d’enrichissement. L’alimentation couvrira les besoins journaliers et sera complétée par des friandises. Un programme d’enrichissement sera mis en place (recherche et diversité de l’alimentation, manipulation d’objets, échelle, musique, tv…) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Pour limiter le stress, nous recourrons à l’habituation (renforcement positif). Elle sera effectuée par le personnel en charge de l’étude et en collaboration avec le personnel d’animalerie. Les animaux seront habitués à recevoir des récompenses (friandises) après réalisation de tâches simples (ex : toucher un objet) afin d’obtenir la coopération de l’animal et instaurer une relation de confiance. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant et sous monitoring cardio-pulmonaire. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur et l’inconfort des animaux. Ces points limites seront des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence des animaux. Les animaux seront pesés à réception puis à chaque manipulation nécessitant une sortie de cage. Des mesures préventives seront prises : médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs, notamment après le retrait des cathéters, l’animal pourra recevoir une injection d’un antidouleur au site de pose du cathéter. Nous aurons recours le plus possible à la réutilisation d’animaux inclus dans d’autres projets sous condition qu’ils n’aient subi aucun dommage cérébral, ni locomoteur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix de cette espèce se justifie par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques femelles pubères seront utilisées pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubères. Pour cette étude, des macaques femelles seront utilisées. Actuellement des macaques femelles sont utilisées au sein de l’EU et seront disponibles à la réutilisation. Cela sera en accord avec les principes de réduction et de raffinement édictés par la règle des 3R. De plus, nos équipements d’imagerie actuels ne peuvent pas supporter la forte corpulence de macaques mâles adultes (poids et largeur d’épaule sont souvent trop importants pour le stade de développement souhaité).