Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-684465)
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour surexprimer la télomérase et développer une maladie rénale, elles reçoivent de la doxycycline dans l’eau de boisson puis des injections intra-péritonéales quotidiennes d’un inhibiteur pendant sept à vingt et un jours, avant mise à mort pour prélever les reins. Le projet cherche à savoir si une protéine, le TGF-b, intervient dans l’effet d’une autre cible sur la progression de la maladie, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que la complexité de la maladie interdit une étude sur cellules et conclut que l’objectif « nécessite le recours à l’expérimentation animale ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale chronique très agressive, de progression rapide et associée à un mauvais pronostique. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique pour cette pathologie rénale, et les patients souffrant de HSF suivent par défaut les mêmes protocoles thérapeutiques que ceux utilisés pour traiter les autres maladies rénales chroniques. Toutefois, les patients atteints de HSF présentent une faible réponse à ces traitements, leur fonction rénale ne s’améliore pas, et la grande majorité d’entre eux développent une insuffisance rénale terminale les obligeant à subir des dialyses puis des greffes de rein pour pouvoir survivre. Les causes de la HSF sont inconnues, mais des facteurs génétiques et cliniques sont associés au développement de cette maladie, tels qu’une inflammation anormalement maintenue, la consommation de médicaments, et un large spectre d’infections virales incluant le VIH. Aussi, les évènements moléculaires associés à l’initiation et à la progression de cette maladie restent méconnus. Toutefois, des études précédentes ont montré qu’une voie de signalisation importante pour la physiopathologie de la HSF impliquait la télomérase. En effet, l’augmentation anormale de l’expression de la télomérase chez la souris provoque un dysfonctionnement de la fonction de filtration rein qui montre alors les caractéristiques histologiques de la HSF. Ces souris permettant de surexprimer la télomérase représentent donc un modèle robuste de la HSF. Aussi, l’étude de ces souris a montré que le ciblage pharmaceutique de la protéine X (pX) permet de limiter les effets néfastes de la télomérase sur le rein. Cet effet bénéfique de la modulation de pX sur la progression de la HSF apparaît être associée à une stimulation du processus de sénescence dans le rein et à une augmentation du facteur de croissance transformant-b (TGF-b). TGF-b est une molécule décrite comme une cible de pX qui augmente la sénescence dans différents organes. Dans ce projet, nous allons déterminer si l’augmentation de TGF-b est nécessaire pour l’effet thérapeutique observé lors de la diminution de pX chez les souris surexprimant la télomérase. Pour ce faire, nous allons tester l’effet de deux inhibiteurs de TGF-b sur la progression de la HSF chez des souris invalidées pour pX et surexprimant la télomérase. Ce travail permettra de mettre en évidence de nouvelles stratégies pour le traitement des patients atteints de HSF.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La télomérase est surexprimée dans le rein des patients souffrant de la hyalinose segmentaire et focale, une pathologie rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale, et caractérisée par la reprogrammation des cellules rénales responsables de la filtration du sang, les podocytes, en cellules dédifférenciées et prolifératives. Nos résultats montrent que l’invalidation ou l’inhibition pharmaceutique de pX permet de restreindre les fonctions non-canoniques de la télomérase et ainsi d’empêcher la dérégulation des podocytes induite par la surexpression de la télomérase chez la souris adulte. Le projet présenté dans ce PEA permettra de déterminer si la modulation de pX réfrène la progression de la hyalinose segmentaire et focale via une stimulation de TGF-b dans ce contexte. Ce travail permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber l’activité́ pro-proliférative de la télomérase dans une pathologie rénale associée à la prolifération des podocytes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux vont être taités à la doxycycline dans l’eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d’atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l’hydratation des animaux. Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale d’inibiteur de TGF-b toutes les 24h dès le début du traitement à la doxycycline. Les injections seront effectuées alternativement à droite et à gauche de la ligne médiane abdominale. Les animaux seront injectés avec l’inhibiteur pendant 7 jours, 14 jours ou 21 jours. A l’issue de ces injections, les animaux seront sacrifiés et les reins seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La protéine pX est exprimée dans toutes les cellules du corps, mais avec des niveaux différents en fonction des organes ainsi qu’en fonction des types cellulaires au sein d’un même organe. L’organe montrant la plus forte expression de pX est le testicule. Ainsi, les souris mâles qui n’ont plus de protéine pX montrent des performances de reproduction amoindris. Cependant, aucun phénotype dommageable n’est observé chez ces animaux qui n’ont plus de protéine pX (femelles et mâles). Deux caractéristiques physiologiques observables sont associées à l’augmentation de l’expression de la télomérase chez la souris adulte : 1) La pousse accélérée des poils, suivi par leur perte. Ce phénotype n’a aucun impact sur le bien-être des animaux, et l’hébergement des animaux en groupes de 2 à 4 souris par cages favorise le maintien de la température corporelle des souris malgré la diminution de la densité des poils. Aussi, l’ajout systématique de carrés de coton dans les cages permet aux animaux de faire un nid, et ainsi favorise le maintien de la température corporelle. 2) La perturbation des cellules du rein, associée à un dysfonctionnement de la filtration rénale et au développement de la HSF.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de cette procédure expérimentale afin de permettre l’analyse histologique et moléculaire de leurs reins.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet d’expérimentation animale s’appuie sur des études préalables réalisées in vitro décrivant les processus moléculaires associant pX, TGF-b et le processus de sénescence cellulaire. Cependant, la HSF est un processus pathologique complexe, et l’étude du rôle de TGF-b sur la progression de cette maladie ne peut pas être réalisé sur des cellules en culture. Ainsi, par définition, cet objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.
2. Réduction
En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Deux groupes de souris témoins (génotype sauvage et génotype i-TERTci) sont prévus afin d’évaluer les potentiels effets secondaires des inhibiteurs utilisés. Nous commencerons par réaliser le protocole sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Le protocole expérimental ne sera réalisé sur ces groupes que si nous notons un effet significatif des inhibiteurs employés sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un minimum de 90 animaux, et un maximum de 270 animaux.
3. Raffinement
L’évolution de la pathologie rénale sera surveillée étroitement dès le début des procédures. Aussi, dans le but de limiter l’impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par les procédures expérimentales décrites dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grilles de score. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin i-TERTci utilisé dans ce projet, est un modèle de souris génétiquement modifiées déjà disponible au sein de notre animalerie qui présente les caractéristiques de la hyalinose segmentaire et focale (HSF) décrite chez l’Homme. Ce modèle est croisé avec des souris invalidée pour pX, et nos résultats montrent que cette invalidation restreint l’initiation et la progression de la HSF chez les souris i-TERTci. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d’animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires mondiaux permettant de répondre aux questions scientifiques posées dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la pénétrance du phénotype chez les souris i-TERTci est la plus élevée.