Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 03/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-434592)
2 394 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent du busulfan puis une greffe de cellules immunitaires humaines, avec prélèvements sanguins répétés et imagerie par bioluminescence. Le porteur décrit une possible réaction du greffon contre l’hôte, avec perte de poids importante, poils hérissés et prostration. Il affirme que la complexité de l’effet des cellules NK ne peut être reproduite in vitro et que seules les souris NOG acceptent les greffes humaines.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les objectifs du projet sont : 1) Mise au point d’un modèle de souris permettant la prise de greffe des cellules NK et des cellules T régulatrices du système immunitaire 2) Validation d’un modèle récapitulant la lyse de cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) test des inhibiteurs de la lyse des cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) Etude de la persistance des CAR-Tregs en présence de l’inhibiteur de l’activité cytolytique des cellules NK.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus du projet sont 1) l’identification d’un inhibiteur permettant de protéger notre produit thérapeutique contre la lyse des cellules NK et ainsi de garantir leur efficacité chez le patient 2) obtenir des données précliniques de sécurité de l’inhibiteur identifié avant tout test chez l’humain dans des maladies autoimmunes comme la sclérose en plaque ou la maladie de Crohn.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
24h avant l’injection des cellules NK, une injection de busulfan sera réalisée. L’injection du busulfan et des cellules prend environ 1 minute par souris, une seule injection par animal. Selon notre expérience, la dose de busulfan que nous utilisons n’est pas toxique pour la souris. Après 8 à 9 semaines, une deuxième injection de cellules humaines sera réalisée (1 min par souris), Nous prélèverons 100 uL de sang tous les 14 jours à partir de J14 (jusqu’à J56 maximum) ou J21 (jusqu’à J63 maximum) après injection des cellules humaines en fonction des résultats obtenus lors de la procédure de mise au point du modèle puis un prélèvement terminal de plus de 100uL soit au total 4 à 5 prélèvements. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2minutes/souris maximum. Le prélèvement terminal sera fait sous anesthésie locale et générale gazeuse sans réveil (anesthésie gazeuse à l’isoflurane 5% (mélange isoflurane/air) pendant 3minutes pour le prélèvement et mise à mort par asphyxie progressive par augmentation graduelle de la dose de CO2 qui prend environ 5min). L’anesthésie locale prend environ 3 à 4 min/souris. Pour l’analyse par bioluminescence, les souris seront injectées avec un produit permettant la bioluminescence. L’injection prend environ 1 min par animal à chaque analyse hebdomadaire, 3 analyses maximum. Pour cette analyse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l’imagerie (3 anesthésies maximum). L’analyse dans le bio-imager prend environ 25min pour 5 souris à la fois. La douleur des animaux pourra être atténuée par injection de buprénorphine.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Perte de poids qui se résout entre 5 et 7 jours après injection du busulfan. Développement de signes de rejet de l’hôte par le greffon qui est une réaction immunitaire entraînant une réaction inflammatoire sévère due à la réaction des cellules immunitaires humaines greffées contre les tissus de la souris. Ces signes se caractérisent par une perte de poids importante, une pilo-érection et la prostration de l’animal. Les nuisances liées aux gestes techniques sont pour l’injection intra-peritonéale la perforation de l’intestin ou de la vessie, un durcissement de la région abdominale; pour les injection en intra-veineuse, la formation d’un hématome au point d’injection, d’une plaie pouvant aboutir à une nécrose ou à une mort subite en cas de bulle d’air dans la seringue; pour les prélèvements de sang en sub-mandibulaire, une hémorragie et une plaie au site de prélèvement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour des prélèvements d’échantillons biologiques. Les animaux surnuméraires qui n’ont pas reçu le produit thérapeutique seront réutilisés pour la formation du personnel et le maintien de leurs compétences puis également mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Avant toute administration de produit à visée thérapeutique chez l’homme, la mise en évidence de l’efficacité et de l’innocuité du produit doit être démontrée chez l’animal. En effet, l’emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique de l’impact des cellules NK sur les Tregs et de leur éventuelle protection à long terme due à la distribution des cellules dans l’organisme.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l’obtention de résultats statistiquement pertinents.
3. Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d’animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) et un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification…). Un apport de gel hydrique dans la cage est réalisé pour simplifier l’accès des animaux à une source hydrique et sera mis à disposition des animaux dès le début de leur hébergement pour les habituer à cette source hydrique. Les souris immuno-déficientes NOG sont hébergées en portoir ventilé par groupe de 5 souris maximum par cage dans la zone SOPF de l’animalerie. Pour la préhension des animaux et éviter le stress nous utiliserons un tunnel auquel nous les habituerons lors de leur phase d’acclimatation. Si possible, nous ferons un suivi longitudinal des cellules humaines injectées par bioluminescence. Pour les études par bioluminescence les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse en air. Pour limiter la douleur des animaux, des analgésiques de type morphiniques pourront être administrés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Seules les souris immunodéficientes comme la souche NOG acceptent les greffes de cellules humaines. Il n’existe pas d’autre modèle animal immuno-déficient. L’injection de cellules humaines dans une souris immuno-compétente ou des primates ne serait pas possible car les cellules et les tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire murin ou du singe (xénogreffe). Souris adultes de 6-8 semaines car la prise de greffe des cellules NK prend environ 4 à 6 semaines selon la littérature pour pouvoir analyser leur effet sur les cellules T régulatrices dans des souris adultes de 10-14 semaines qui auront alors un poids relativement stable en fin de croissance. A ce stade de développement, les souris sont plus facilement manipulables pour les prélèvements et l’analyse des échantillons et d’évaluation physique (bien-être)