Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-324707)
164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie crânienne de quatre à six heures avec ouverture d’un volet crânien et implantation d’électrodes, puis des enregistrements répétés pendant le sommeil, certaines étant soumises à un conditionnement associant un lieu à des stimulations électriques de la paupière avant d’être tuées pour localiser les électrodes. Le porteur reconnaît des risques d’hémorragie, d’infection du tissu cérébral et de prostration liée au conditionnement aversif, tout en indiquant que les animaux disposent de zones de repli. Il décrit ces travaux sur la mémoire comme « incontournables » et juge la souris « centrale » faute de modèle in vitro ou invertébré équivalent.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La mémoire est une faculté essentielle qui permet d’acquérir et de stocker des informations pour ensuite adapter un comportement en fonction de l’expérience. De nombreuses études ont montré que les oscillations cérébrales jouent un rôle crucial dans la consolidation de la mémoire pendant le sommeil. Étudier ces mécanismes permet de mieux comprendre le rôle des différents états de vigilance afin de préserver nos capacités cognitives dans un contexte général de réduction du temps de sommeil, mais aussi pour envisager des pistes thérapeutiques aux pathologies telles que l’insomnie chronique. Les techniques standards d’enregistrement de l’activité cérébrale pour l’étude du sommeil sont l’IRM fonctionnelle chez l’homme et les primates non-humains d’une part, et les enregistrements électrophysiologiques dans les modèles rongeurs, d’autre part. Ces deux techniques présentent des inconvénients de taille : l’IRM fonctionnelle est coûteuse et bruyante, tandis que l’électrophysiologie souffre d’une faible résolution. Une nouvelle modalité, l’imagerie ultrasonore fonctionnelle, permet de mesurer les variations de flux sanguin cérébral dans plusieurs régions du cerveau simultanément, avec une bonne résolution spatiotemporelle. Elle est facile à mettre en place, portable et abordable. A ce jour, l’imagerie ultrasonore couplée à l’électrophysiologie est tres prometteuse pour observer finement l’ensemble des régions cérébrales activées lors des processus de consolidation. Les études précédentes en imagerie ultrasonore fonctionnelle ont été réalisées sur des rats vigiles ou pendant le sommeil paradoxal : nous manquons donc de données précises sur le sommeil lent. Or, c’est précisément pendant le sommeil lent que les mécanismes de consolidation mnésique (appelés réactivations) ont été mis en évidence. Les corrélats à grande échelle de ces réactivations n’ont été examinés que chez le singe, d’où la pertinence de ce projet. Le but de ce projet est donc double : 1- imager les réseaux associés aux réactivations à l’échelle du cerveau entier et 2- examiner les dynamiques spatiotemporelles de l’apprentissage aversif/appétitif, qui module fortement ces réactivations. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de consolidation de la mémoire sur le plan fondamental, ainsi que le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de pathologies comme le syndrome de stress post-traumatique ou la maladie d’Alzheimer
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes électrophysiologiques impliqués dans la consolidation de la mémoire notamment dans le cas de la mémoire émotionnelle. Ces travaux apparaissent comme incontournables afin de pouvoir améliorer notre compréhension de la dynamique spatiale et temporelle de la consolidation de la mémoire, mais aussi des régions cérébrales associées spécifiquement la mémoire aversive et la mémoire appétitive. Les données acquises dans le cadre de ce projet permettront à court terme de mettre en lumière de nouvelles régions d’intérêt pour l’étude de circuits par des techniques comme l’optogénétique ou l’électrophysiologie et dans le long terme pour l’évaluation de troubles mentaux permettant d’anticiper leur apparition et d’améliorer la prise en charge des patients. Par l’utilisation du modèle rongeur, nous serons donc en mesure de mettre nos résultats en lien avec une littérature fournie et de constituer une nouvelle base de données pour d’autres laboratoires. De plus, l’anatomie du modèle souris étant bien décrite, nous serons en mesure de transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d’autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourront également permettre une meilleure évaluation de l’état émotionnel de l’animal, thématique d’importance croissante dans l’amélioration du bien-être animal.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’ensemble des animaux de ce projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale comprenant une implantation d’électrodes ainsi qu’un volet crânien, pour une durée moyenne de 4h à 6h. Une période stricte de récupération de 7 jours sera observée au cours de laquelle un suivi et une prise en charge de la douleur post-opératoire sera effectué. A l’issue de cette période, un premier groupe d’animaux ne subira aucun enregistrement réel, mais des enregistrements simulés avec une ‘fausse’ sonde afin d’évaluer les effets du port répété de celle-ci. Un suivi longitudinal permettant d’évaluer visuellement la qualité du volet crânien, la stabilité de l’implant et le comportement de l’animal sera effectué, ainsi qu’un suivi de la douleur. Pour un autre groupe, à l’issue de cette période d’habituation de 2 à 5 jours, les animaux suivront un protocole d’enregistrement de 2h30, pendant leur sommeil directement dans leur cage et du comportement dans un labyrinthe enrichi, ce qui permettra d’établir des cartes d’activations associées au sommeil. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Un dernier groupe d’animaux subira à la place un protocole d’association d’un endroit de l’environnement à des stimulations agréables, désagréables ou mixtes. Les stimulations agréables seront des récompenses directes comme de l’eau chocolatée (selon les préférences individuelles). Les stimulations désagréables seront des stimulations électriques calibrées (stimulation électrique bénigne de la paupière) n’occasionnant qu’un inconfort bref et générant un comportement de fuite caractéristique puis de ‘freezing’. Les animaux bénéficieront toujours d’une large zone neutre vers laquelle se réfugier pour ne plus subir de stimulation désagréable. Ils seront ensuite replacés dans leur cage afin d’étudier les réactivations associées à cette expérience. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Tous les animaux seront enfin euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les animaux impliquant notamment une procédure chirurgicale. Les autres effets indésirables sont liés au protocole d’enregistrement et à l’isolement des animaux. Cela implique donc un suivi longitudinal soutenu et une évaluation quotidienne de la douleur de l’animal. Les effets indésirables liés à la chirurgie sont, à court terme, liés aux risques per-opératoires (hémorragie, hypovolémie, etc.) et à moyen terme, aux risques de complications post-opératoires et d’infection locale du tissu cérébral. Dans une moindre mesure, le tissu cérébral (bien que protégé) est plus vulnérable aux chocs mécaniques, en l’absence de barrière osseuse au-dessus de la zone d’imagerie. A long terme, les effets indésirables majeurs sont liés au poids et à la taille de l’implant, ainsi qu’au stress mécanique pouvant résulter des chocs répétés contre les parois de la cage. Les effets indésirables liés au protocole d’enregistrement lui-même sont limitées en termes de douleur : le matériel d’enregistrement étant miniaturisé, le poids sur la tête de l’animal est réduit. Cependant, l’utilisation d’un câble, même souple, restreint la liberté de mouvement de l’animal et peut occasionner son enroulement, ce qui augmente l’inconfort de l’animal. La répétition de sessions d’enregistrement quotidiennes peut aussi détériorer la stabilité de l’implant, ce qui peut, à terme, diminuer la qualité des enregistrements et favoriser les risques cités plus-haut. Enfin, le protocole de conditionnement aversif implique d’utiliser des stimulations désagréables (ou très légèrement douloureuses) pour l’animal (nécessaire afin d’étudier la mémoire aversive) ce qui peut modifier le comportement de l’animal sur le long terme et occasionner des comportements telle que la prostration. Ces animaux bénéficieront cependant toujours de larges zones de « repli » dans lesquelles ils ne subiront pas de stimulations.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d’activation, nombre, localisation) des neurones qui ont été réactivés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre objectif est d’étudier les réactivations neuronales à l’échelle du cerveau entier suivant un apprentissage spatial neutre, ou aversif. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple. De plus nous souhaitons étudier à la fois les réponses électrophysiologiques et vasculaires mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (notamment pendant l’apprentissage). Enfin, les tests comportementaux, mécanismes de la consolidation mnésique et disponibilité des modèles génétiquement modifiés rende le modèle souris central a l’étude de la mémoire. C’est donc le seul modèle réunissant tous ces critères.
2. Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux dans chacun des groupes, nous améliorerons l’efficacité de la procédure chirurgicale et le suivi longitudinal des animaux. Le nombre d’animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Les comparaisons entre groupes expérimentaux seront réalisées avec des tests paramétriques (student ou Anova). Si les données ne suivent pas une loi normale, nous utiliserons des tests équivalents non-paramétriques (Mann- Whitney, Friedmann). Dans la littérature ainsi que selon nos précédentes publications, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats significatifs au niveau histologique est de 5 animaux/groupe pour les groupes contrôle et de 15 animaux/groupe pour les groupes test. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des implantations d’électrodes et de la qualité des images obtenues, de l’efficacité de l’apprentissage spatial et de la volonté des souris à explorer l’environnement, nous nous attendons à 50% de succès, pour l’approche histologique, soit un nombre total d’animaux de 10/groupe pour les groupes contrôles et de 30/groupe pour les groupes où une quantification histologique sera effectuée. Pour les études comportementales couplées à l’électrophysiologie, il est cependant préférable de disposer d’au moins 12 animaux/groupe. Pour améliorer l’utilisation des animaux, nous utiliserons des analyses basées sur des réseaux de neurones artificiels qui nécessitent 3 sous-groupes : pour entrainer le réseau de neurones, adapter les hyper- paramètres et pour obtenir les résultats. Il est donc nécessaire de disposer d’un nombre suffisant d’animaux pour chaque sous-groupe (le nombre minimum est de 4), mais la puissance des analyses en sera très fortement augmentée. De plus plusieurs hypothèses sur les modifications des réseaux de neurones pourront être testées sans avoir besoin de refaire des expériences sur de nouvelles souris. En plus des 50% de succès décrits précédemment d’autres facteurs limitant interviennent. L’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne diminuent le taux de succès des expériences comportementales de 30% supplémentaires. Les lots d’animaux expérimentaux à prévoir pour la tâche 2 comprendront donc 36 animaux/groupe.
3. Raffinement
Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Le contact entre l’animal et l’expérimentateur sera facilité par une période d’habitation et de manipulation simple (2 expositions quotidiennes pendant 5 jours) permettant de réduire le stress de l’animal au contact de l’expérimentateur et donc la variabilité des résultats expérimentaux. Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l’animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l’expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacogénétique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux. Nous utiliserons des souris sauvages C57Bl/6. La procédure de fenêtre crânienne et de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 8 et 10 semaines pour réaliser les implantations d’électrodes. Les enregistrements seront réalisés jusqu’à 4 mois après l’implantation.