Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-791430)
48 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux interventions chirurgicales sous anesthésie et un prélèvement de 30 ml de sang. Une matrice trachéale décellularisée est implantée dans un muscle pour tester sa vascularisation, avec ou sans immunosuppresseur, en vue d’un futur remplacement de trachée chez l’enfant. Le porteur indique que tous seront tués à l’issue de la seconde intervention pour prélever la matrice, tout en évoquant par ailleurs un possible retour à la ferme pour une partie des animaux. Il présente le recours à l’animal comme « indispensable » avant des essais cliniques, le porc ayant une trachée proche de celle de l’homme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Chez l’enfant, plusieurs pathologies trachéales congénitales en échec de traitement pourraient bénéficier d’un remplacement trachéal. A ce jour, il n’existe pas de stratégie consensuelle. La technique de décellularisation par ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse : l’élimination des cellules, de leur matériel génétique et de leurs antigènes permet d’obtenir une biocompatibilité accrue avec un risque de rejet faible ; d’autre part, le respect des propriétés biochimiques et biomécaniques de la matrice extracellulaire garantit les capacités de biointégration, limite les risques de malacie cartilagineuse et évite la pose d’un stent prolongé. Nous avons fait le choix de la décellularisation et avons développé une technique fiable et reproductible d’obtention d’une matrice trachéale décellularisée. La première phase du remplacement trachéal est une étape préliminaire de maturation. Elle consiste à implanter la matrice dans un muscle afin d’obtenir une vascularisation adéquate pour assurer la survie du greffon. La néovascularisation induite permet la biointégration et la colonisation cellulaire ; en contrepartie, elle expose également la matrice extra-cellulaire a des phénomènes immunitaires de réaction à corps étranger. Cette réponse non spécifique peut induire une biodégradation rapide et/ou fibrose et sténose. Pour cette raison, l’utilisation d’un traitement immunosuppresseur provisoire durant la phase de maturation pourrait être bénéfique, a fortiori chez l’enfant, chez qui les indications de remplacement sont exceptionnellement tumorales. Ce projet a pour objectif principal de comparer, avec et sans traitement immunosuppresseur, la biointégration d’un substitut trachéal lors de la phase de maturation de la matrice. L’objectif secondaire de ce projet est d’évaluer la durée minimale de maturation pour obtenir une néovascularisation efficace.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
En plus des résultats cliniques, mitigés, déjà publiés, l’une des raisons empêchant un passage en clinique des biomatériaux pour un remplacement trachéal est l’absence d’étude rigoureuse préclinique, dans un modèle animal représentatif de l’anatomie humaine. Ce projet est la première étude systématique de biointégration de MTD dans un modèle porcin. Les bénéfices à court terme seront (1) la connaissance des mécanismes immunologiques en jeu dans la biointégration d’un tissu décellularisé, (2) la détermination de la durée adéqutae de préparation de la matrice à l’implantation afin d’obtenir une vascularisation efficace, (3) l’étude de l’efficacité et la pertinence d’un traitement immunosuppresseur dans un modèle porcin. Les bénéfices à long terme de cette étude seront la preuve de concept de la bio-intégration d’une matrice décellularisée et le passage en clinique pour des remplacements trachéaux. De plus, des résultats positifs permettront d’élargir les indications aux sténoses trachéales courtes. L’interposition d’un tissu biocompatible pourrait être une aide chirurgicale pour limiter les tensions des sutures et les sténoses secondaires. Enfin, le recours à un tissu biocompatible pour d’autres indications de chirurgie des voies aériennes pourrait être possible, notamment pour les chirurgies de sténose du larynx.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
24 porcs auront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 45 minutes. Un prélèvement sanguin de 30 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 15 jours à 60 jours, en fonction des sous-groupes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle sterno-céphalique peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. Pour les animaux qui auront un traitement par immunosuppresseurs, la susceptibilité aux infections est augmentée durant toute la durée du traitement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la deuxième intervention pour prélèvement de la matrice trachéale implantée, et pour le prélèvement de la trachée native.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la bio-intégration d’un substitut au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.
2. Réduction
Nous avons déjà débuté les procédures chirurgicales d’implantation sterno-céphalique (Procédure 1) sur des porcs mis à mort dans d’autres expérimentations animales. Ces chirurgies préliminaires nous permettent d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au prélable. Cette stratégie nous permet de ne pas créer de sous-groupe d’étude préliminaire. Le nombre total d’animaux a été calculé en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Pour des analyses significatives comparatives, le nombre de 4 animaux dans chaque bras (avec ou sans traitement) pour chaque durée de maturation (J15, J30 ou J60) a été défini a priori, soit 24 animaux au total. Le critère d’évaluation principal est l’activité inflammatoire au sein de la MTD. Les paramètres étudiés seront : la nécrose du muscle sterno-céphalique, la dégradation de la MTD, la présence de trous au sein de la MTD, la réduction de calibre, la quantité d’anticorps antiHLA, la quantité d’ADN circulant, l’infilitration cellulaire et sa caractérisation, les taux plasmatiques de cellules inflammatoires et le taux de cytokines. Lors de l’explantation de la MTD maturée, la trachée native réséquée est prélevée pour des études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.
3. Raffinement
La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort pour raisons humanitaires. Pour les porcs qui seront mis à mort à 60 jours, un retour à la ferme sera envisagé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs bénéficiant de remplacement trachéal par aorte cryopréservée ou par substitut trachéal ont déjà été étudiés et publiés. Enfin, les mécanismes immunologiques porcins ont été bien décrits. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe, avec ou sans traitement immunosuppresseur. Animaux mâtures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez chez les animaux en croissance (juvéniles). L’âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.