Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/05/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-841953)
168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à « phénotype nocif ». Le porteur indique n’attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu’aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l’animal demeure « crucial ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l’impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l’établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d’imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l’excès de teinture – 10 minutes d’imagerie par point de temps – Expérience de 30 jours (maximum) – Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l’animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : – 10 minutes d’imagerie par point de temps – Expérience de 60 jours (maximum) – Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l’animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux – 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) – Expérience de 90 jours – les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l’ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l’eau ou par injection intrapéritonéale. – Injection intrapéritonéale avec un temps d’anesthésie inférieur à 5 minutes. – Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L’administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d’absorption. 4. Choc thermique local – Moins de 1 minute pour le choc thermique – 10 minutes d’imagerie par point de temps – Expérience de 90 jours (maximum) – Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d’aileron pour le génotypage – Moins de 1 minute par clip d’aileron – Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d’animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu’à l’âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu’à 2 ans après la fécondation.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d’alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c’est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d’ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organe et analyse (histologique, moléculaire)
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L’utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
2. Réduction
La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l’exigence d’un plus grand nombre d’animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d’animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d’utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d’animaux demandé est le plus grand nombre d’animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d’utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d’imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d’animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.
3. Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : – Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux – Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu’à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d’imagerie qui ne sont pas possibles avec d’autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d’autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d’acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d’ablation génétique, font du poisson zèbre l’organisme idéal pour l’expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l’établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l’âge adulte pour comparer l’apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu’aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l’on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).