Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 26/06/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-363288)
1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d’une mutation du gène tau, elles subissent des tests de mémoire, une privation d’eau limitant l’accès à dix minutes par jour et une diète déplétant les cellules immunitaires du cerveau, pour étudier le rôle d’ApoE4 dans la maladie d’Alzheimer. Le porteur indique qu’environ 15 % des souris développent une paralysie progressive des membres postérieurs et que des crises d’épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion peuvent survenir, avec mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro et juge le modèle murin « indispensable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie d’Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L’apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L’isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA tau par 3 modules : 1) Identifier comment ApoE4 modifie la fonction des synapses endommagées par la MA. 2) Identifier comment ApoE4 modifie la structure des synapses endommagées par la MA. 3) Identifier si ApoE4 utilise les microglies (cellules immunitaires du cerveau) pour exacerber la perte synaptique. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les interactions entre l’ApoE4 et la perte des synapses dans la MA. Nous utiliserons un modèle de souris qui reproduit la perte synaptique comme observée chez les patients MA.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4 et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des et microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d’Européens atteints de la maladie d’Alzheimer doublera presque d’ici 2050, soulignant l’urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d’Alzheimer avant qu’elle n’atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu’un traitement qui retarde l’apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Une biopsie rapide de l’oreille (permettant l’identification et le génotypage des animaux) (2 secondes) – Trois tests comportementaux pour évaluer la mémoire (1 semaine à 3 semaines) – Une euthanasie sous anesthésie/analgésie (unique, 1 minute) – Possible développement d’un phénotype dommageable à partir de 7 mois (15% des souris P301S, développement progressif de quelques semaines à 1 mois) – Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois) – Une privation en eau contrôlée (accès à l’eau 10 minutes par jour )
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Il n’y pas d’effet indésirable attendu sur les animaux lié à l’utilisation des traitements proposés (diètes). En ce qui concerne le comportement, il s’agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux. Les animaux seront privés en eau pour créer un niveau de motivation suffisant pour apprendre et mémoriser les indices olfactifs lors de l’helico Maze. Les souris seront privées en eau de la façon suivante: accès à l’eau 10 minutes par jour 5 jours avant le premier jour d’expérimentation. Puis, lors des jours d’expérimentation (5) les souris auront accès à l’eau pendant 10 minutes chaque jour en plus de l’eau bue pendant l’expérimentation. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis). Les animaux issus de la procédure 2 seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque. Une heure avant l’injection d’anesthésiques, nous injecterons un analgésique en sous-cutané .
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour la partie du projet permettant la création et le maintien de lignées de souris transgéniques à phénotype dommageable, une partie des souris sera utilsée pour la deuxième procédure, l’autre partie sera mise à mort à la fin de la procédure. Pour la partie du projet avec les analyses comportementales, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations « physiopathologiques » très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n’étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables. Les souris P301S transgéniques permettent de reproduire ces symptômes mnésiques de la MA ainsi que les mécanismes à l’origine de ces troubles.
2. Réduction
Afin de calculer au plus juste l’effectif des lots d’animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
3. Raffinement
Les souris seront hébergées sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C(±1°C) dans des portoirs ventilés (12vol/h), sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec la privation en eau ; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l’expérience, la souris sera exclue du test comportemental et aura un accès illimité à l’eau afin de recouvrer un poids normal. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l’âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l’eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l’eau. Ce processus, lorsqu’il se produit, progresse au cours des semaines à plus d’un mois. Points limites : Perte de plus de 20% du poids : euthanasie. Signes de souffrances continues (prostration, dos courbé, …) : euthanasie. Incapacité à se déplacer pour atteindre l’eau ou la nourriture : euthanasie. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris P301S sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d’une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Si elle fait partie d’une procédure, les dents seront taillées chaque semaine par le personnel vétérinaire et le poids sera surveillé. Sinon, la souris sera euthanasiée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et les souris génétiquement modifiées P301S exprimant la protéine tau humaine mutée menant au développement de la perte synaptique et des troubles cognitifs. Ces souris seront croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4. – Une cohorte sera utilisé à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d’évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle – Une cohorte sera utilisé à 10 mois (avec tests comportementaux e un mois à une semaine avant) afin d’évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle