Reprise de la production des cellules sanguines après irradiation chez le porc Miniature (EU1/2)

Ce projet a pour objectif de proposer un nouveau traitement du syndrome aigu d’irradiation (SAI), pour le militaire en opération ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Il est basé sur une technologie permettant de produire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenue à partir de cellules souches reprogrammées issues de cellules humaines. Ces cellules d’origine humaine sont nommées hiPSC et ont commencé à révolutionner les pratiques médicales. Le traitement en urgence de population nécessite de disposer de produits cellulaires pouvant être congelés, décongelés et injectés rapidement et permettant de traiter un groupe important d’individu. Ces banques de cellules souches dites « médicament » permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles. Le projet a pour ambition de démontrer que cette stratégie d’utilisation des hiPSC est la réponse thérapeutique au traitement en masse du syndrome aigu d’irradiation. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies internationales en termes de santé et de médecine régénérative, à savoir la constitution de banques d’hiPSC de grade clinique (à savoir excellente viabilité et absence d’anomalie chromosomique) et la dérivation de produits cellulaires de qualité. L’objectif est la validation après la destruction des cellules de la moelle osseuse par l’irradiation de la reprise de l’hématopoïèse chez le cochon par une injection de cellules souches humaines hématopoïétiques issues d’hiPSC. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique.

La preuve de concept de la possibilité de générer un tissu sanguin fonctionnel (l’ensemble des cellules du sang) à long terme à partir d’un tout nouveau type cellulaire appelé « hiPSC » a été établie chez le petit animal. Cette nouvelle technologie permet de produire les cellules à l’origine de la production du sang. Le traitement en urgence de populations nécessite de disposer de produits congelables afin de traiter un groupe d’individus. Des banques de cellules souches obtenues à partir d’hiPSC de grade clinique permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles et transposable à une échelle industrielle. L’objectif de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique. Pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo, plus particulièrement des animaux de grande taille et dont la physio-pathologie du SAI est proche de l’homme. La validation de la reprise d’hématopoïèse humaine xénogénique chez le cochon par une greffe de cellules souches hématopoïétique issues hiPSC et également de la sous population de cellules triée à partir de ces hiPSC (la sous population à capacité de reconstituer l’hématopoïèse) permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique. Le bénéfice de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique chez l’homme.

Une prise de sang sera effectuée à J-4 et J0 avant l’irradiation et à J3, 7, 10, 35 ,38, 45, 52, 59 et 90 sous anesthésie générale pour un prélèvement à la veine jugulaire de 5ml (temps de prélévement entre 5 et 10 min). A J45 et J90, au cours de cette même anesthésie et associée à une anesthésie locale, sont également prélevés 5 mL de moelle osseuse dans l’humérus (2 min). Les procédures d’irradiation sont réalisées en une seule fois pour une durée de 5 min sous masque et isoflurane après une anesthésie générale. Les injections de cellules sont effectuées en une seule fois sous anesthésie à la veine de l’oreille par un système de perfusion et sous monitoring cardiaque et respiratoire, la durée de l’injection étant de 10 min. Pour éviter tout rejet des cellules humaines les animaux sont traités par des immunosuppresseurs (une première molécule 1 fois par jour de J-3 à J30 soit 34 administrations orales, une deuxième molécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, une 3ième moécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, toutes en prise spontanée dans la nourriture), et une injection unique intra-musculaire d’une 4ième molécule. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention sur l’animal soit maximum 11injections intra-musculaires.

Selon la littérature, ce syndrome est caractérisé par une diminution du nombre de globules blancs dans les 48h premières heures suivie d’une remontée puis de nouveau une chute des neutrophiles de 10 à 22 jours et d’une diminution des plaquettes (avec le taux le plus bas atteint entre 9-17 jours, sur une durée de 2 semaines et récupération à 3-4 semaines et complète à 2 mois post-irradiation). Une chute des globules rouges est notée à J14. La récupération à des valeurs proches de la normalité des cellules du sang se situe à 6 semaines. Aucune perte de poids n’est attendue suite à l’irradiation à faible dose. La survenu transitoire de quelques pétéchies entre J10 et J14 post-irradiation est observée chez quelques animaux. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique du Shotapen à 0,1ml/kg (association de streptomycine et de pénicilline d’une durée d’action de 3 à 5 jours) par voie intramusculaire à chaque intervention sur l’animal si espacée de 72 heures minimum (à l’occasion de prises de sang notamment).

Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J90 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem de poumon, foie, rate, thymus, amygdale, os, intestin afin de localiser la présence des cellules humains greffées.

Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc de 8 semaines qui est un porc de taille et de poids réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production limitée à l’heure actuelle. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté.