Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-687808)
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, deux plaies dorsales leur sont créées au biopsy punch avec pose d’une attelle et de sutures, puis infectées par la bactérie Staphylococcus aureus, avant l’application d’un plasma froid ou d’un antibiotique et quatre prises de sang. Le porteur signale une douleur et une gêne au réveil, ainsi qu’un risque de blessures si les souris se grattent ou se mordent, l’objet étant de tester le plasma froid contre les bactéries résistantes des plaies. Il affirme qu’aucune alternative non animale n’existe pour cette phase et présente le porc, dont la peau est plus proche de la nôtre, comme écarté pour des raisons logistiques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l’efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l’être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l’analyse biologique de la reconstruction de l’épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l’infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.
2. Réduction
Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d’animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d’animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.
3. Raffinement
Dès l’arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l’adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d’un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l’injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire ‘un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d’un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d’un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d’un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d’un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l’évaluation de la douleur, si elle n’est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l’infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.