Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-317501)
438 souris vont être utilisées, en majorité tuées à l’issue et dix-huit femelles réutilisées comme reproductrices, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les phalanges sont tatouées ou amputées pour l’identification et le génotypage, une hypothyroïdie est induite pendant trois semaines par l’alimentation, y compris chez des femelles gestantes, ce qui ralentit la croissance des souriceaux. La plupart des animaux sont ensuite mis à mort après un prélèvement de sang à la veine cave ou une perfusion de fixateur dans le cœur, pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à identifier les gènes cibles de l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus et affirme qu’aucun modèle in vitro pertinent n’existe pour cette structure.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’hormone thyroïdienne est primordiale pour le bon fonctionnement de l’organisme, autant pendant le développement foetal que pendant la vie adulte. Elle régule notamment le neurodéveloppement durant la vie foetale, et le maintien de fonctions vitales, comme la production de chaleur par le corps, à l’âge adulte. L’ormone thyroïdienne agit dans presque tous les tissus de l’organisme. Les perturbations de cette signalisation entraînent des conséquences délétères sur la santé des individus : hypothyroïdie, problèmes de développement cérébral, déficit intellectuel… L’hormone thyroïdiennes agit en activant ou en inhibant la transcription de gènes cibles. Toutefois, ces gènes-cibles sont globalement mal connus et ne sont pas les mêmes d’un tissu à l’autre. Le manque de compréhension des mécanismes d’action de l’hormone thyroïdienne freine le développement de traitements adaptés aux différentes pathologies associées. Ce projet consiste à déterminer les gènes cibles de l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus chez la souris, à la fois chez le jeune et chez l’adulte. Cette aire cérébrale représente un élément essentiel du contrôle des fonctions physiologiques. L’influence qu’y exerce l’hormone thyroïdienne est importante, mais la façon dont cette influence s’exerce, c’est-à-dire la nature des gènes-cibles de l’hormone, est très peu connue.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à faire avancer les connaissances fondamentales dans un domaine dans lequel beaucoup d’inconnues persistent. Il devrait permettre d’effectuer une distinction fondamentale entre les processus développementaux et les régulations physiologiques contrôlés par l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus. À terme on peut en attendre les bénéfices suivants : – une compréhension des liens qui existent entre différents phénomènes qui dépendent de l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus : le déclenchement de la puberté, la perception des saisons, la régulation de l’activité de la glande thyroïde… – des hypothèses innovantes pour des traitements pharmacologiques de l’obésité. L’hormone thyroïdienne donnée en excès est capable d’augmenter la dépense calorique et de provoquer une perte de poids. Un tel traitement reste cependant inenvisageable en raison de ses effets secondaires majeurs (fonte de la masse musculaire et tachycardie). Si nous parvenons à identifier un type cellulaire de l’hypothalamus dans lequel l’hormone thyroïdienne exerce un effet favorable, il sera possible de cibler ces cellules pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques de lutte contre l’obésité, en évitant les effets indésirables sur d’autres organes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris utilisées à l’âge adulte seront identifiées individuellement par tatouage des phalanges à l’âge de 10-12 jours (geste < 1 minute). Une biopsie de queue (< 20 secondes) sera réalisée le même jour sur ces animaux pour pouvoir réaliser des analyses génétiques. Les souris utilisées à l'âge de 15 jours seront identifiées entre 5 et 7 jours d'âge par prélèvement d'une phalange distale sur un ou deux doigts (< 1 minute). Ces prélèvements permettront également de réaliser des analyses génétiques. Des souris adultes seront nourries pendant 3 semaines avec un aliment contenant un médicament qui bloque la fonction de la glande thyroïde et induit une hypothyroïdie. Ce traitement pharmacologique prolongé n’a pas d’effet flagrant chez les adultes, mais peut causer une légère perte de poids. Des mères gestantes seront également nourries avec cet aliment, à partir du 10ème jour de gestation et jusqu'à 15 jours après la mise bas. Ce traitement provoque chez les souriceaux en développement un net ralentissement de la croissance pondérale après la naissance. Des souris adultes et des souriceaux âgés de deux semaines précédemment rendus hypothyroïdiens recevront une injection unique d'hormone thyroïdienne (< 20 secondes). Certaines souris recevront également une injection (< 20 secondes) d'un marqueur de prolifération cellulaire, 24h avant leur mise à mort. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Sur une partie d'entre elles, nous réaliserons un prélèvement sanguin à la veine cave (2-3 minutes), puis elles seront mises à mort sous anesthésie. Sur les autres souris, une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront également mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les actes liés à l’identification des souris et aux biopsies pour analyses génétiques (tatouage des phalanges, biopsie de queue ou de phalange) induisent une douleur aigüe temporaire. Chez la souris adulte, nous induirons une hypothyroïdie temporaire, qui a un effet modéré et réversible. Cela se traduit par une perte de poids modérée (inférieure à 10% du poids initial) et une légère baisse d’activité, qui n’est pas détectable de façon évidente, mais qui peut être mesurée en utilisant des tests comportementaux dédiés. Par analogie avec les données médicales humaines, on peut supposer une fatigue générale. Le médicament utilisé donne un goût amer à l’aliment, ce qui limite la prise de nourriture par les souris. L’induction d’une hypothyroidie au cours de la gestation a des effets significatifs sur le développement des petits. Toutefois, notre expérience passée montre que le degré d’hypothyroïdie atteint dans nos conditions expérimentales ne compromet pas la survie des souriceaux, le seul effet notable étant un retard de croissance (10-15 % de retard pondéral par rapport aux souris témoins). L’injection d’hormone thyroïdienne induit une douleur temporaire liée à l’injection mais ne provoque pas d’inflammation ni d’altération notable du bien-être animal. Le prélèvement d’un grand volume de sang sous anesthésie générale, ainsi que l’injection d’un produit fixateur dans le coeur, également sous anesthésie générale, n’induisent pas de douleur et sont systématiquement suivis de la mise à mort des souris.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
420 souris de ce projet seront mises à mort pour prélèvement de leur cerveau. Les femelles utilisées pour mettre au monde des souriceaux pourront être gardées et réutilisées comme reproductrices au sein de l’animalerie, après une période de récupération d’au moins 2 semaines pour les femelles qui auront reçu l’aliment induisant une hypothyroïdie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’hypothalamus est une structure neurale pour laquelle il n’existe aucun modèle in vitro pertinent. Le recours aux cultures primaires n’est possible pour quelques types cellulaires. Nous avons mesuré la réponse à l’hormone thyroïdienne de cultures primaires de certaines cellules de l’hypothalamus, mais il n’est pas encore démontré qu’elle soit comparable à leur réponse in vivo. Il n’existe pas de situations qui permettraient de prélever des tissus provenant de patients hypothyroïdiens ayant reçu un très court traitement hormonal pour évaluer les modifications d’expression de gènes induites par l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus.
2. Réduction
Les méthodes prévues pour l’analyses du tissu cérébral ont été optimisées pour être applicables avec des quantités minimes de matériel. Pour les études impliquant un séquençage des ARN , notre expérience passée montre que des lots de 6 animaux minimum (3 mâles + 3 femelles) sont requis pour garder une marge de sécurité. L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’une méthode dédiée capable de mettre en évidence des différences mineures avec des effectifs très faibles en prenant en compte une interférence possible entre la réponse hormonale et le sexe des animaux. Toutefois, ces méthodes peuvent conduire à l’élimination occasionnelle d’un échantillon en raison de problèmes techniques. Des animaux surnuméraires permettent également de réaliser des expériences de confirmation (analyse ciblée sur certains gènes identifiés comme intéressants par l’analyse globale). Le nombre de femelles nécessaire pour générer les souriceaux pour l’étude du développement du cerveau a été déterminé sur la base de l’obtention d’environ 6 souriceaux par portée. Nous réutiliserons les femelles pour plusieurs portées. Notre estimation prévoit également de possibles problèmes de reproduction (interruption de gestation, mortalité des souriceaux…).
3. Raffinement
Les souris adultes et juvéniles seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée des procédures. En cas d’approche d’un point limite par l’un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. Chaque femelle sera utilisée au maximum pour 2 gestations sous traitement hypothyroïdien, avec une période de repos d’au moins 15 jours (alimentation normale) entre la mise à mort des petits et la nouvelle mise en reproduction. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée au prélèvement sanguin ou à la perfusion intracardiaque de fixateur. Elles recevront également un analgésique 30 minutes avant induction de l’anesthésie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le recours à des outils génétiques performants et la spécificité du métabolisme énergétique des espèces homéothermes impose le choix de la souris comme modèle. Le mode d’action de l’hormone thyroïdienne, ainsi que la structure des récepteurs, sont similaires chez l’homme et la souris. Des adultes âgés de 2 à 4 mois seront utilisés pour étudier le rôle de l’hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus chez l’adulte. La maturation de l’hypothalamus est considérée comme terminée à l’issue de la puberté. Des juvéniles traités indirectement (via la mère) dès le 10ème jour de vie foetale et âgés de 15 jours en fin de procédure seront utilisés pour étudier le rôle de l’hormone thyroïdienne au cours du développement de l’hypothalamus.