Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-831753)
900 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils subissent pose de cathéters, injections de radiotraceurs, séances d’imagerie TEP d’une heure sous anesthésie et, pour certains, une injection cérébrale stéréotaxique d’un vecteur viral ou d’un agent neuro-inflammatoire, avant une euthanasie par exsanguination pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les radiotraceurs sont administrés à très faible dose et qu’aucune toxicité n’est attendue, les nuisances venant surtout des manipulations. Il décrit de nombreuses caractérisations in vitro et in silico en amont mais conclut que l’étape in vivo reste « indispensable » pour prédire l’affinité et le métabolisme réels.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : – les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; – les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; – l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).
2. Réduction
Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.