Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 26/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-930556)
132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie crânienne d’une heure pour implanter une lentille au-dessus du nerf optique, une partie recevant en plus des injections dans l’œil ou dans le péritoine, puis elles sont observées éveillées ou anesthésiées jusqu’à dix fois sur un an sous stimulation visuelle, avant d’être tuées pour prélever le cerveau, afin d’étudier le couplage entre activité nerveuse et flux sanguin dans le nerf optique. Le porteur signale une douleur postopératoire de trois jours, une inflammation possible de l’œil après l’injection virale et un stress lié à l’imagerie chez l’animal éveillé. Il affirme que l’étude du flux sanguin exige un « animal entier » et que les données in vitro se sont révélées inutilisables faute de circulation.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’hyperémie fonctionnelle est un réflexe déclenché par l’activation neuronale qui aboutit à une augmentation locale du flux sanguin. Ce réflexe, qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’Homme, met en cause un ensemble de mécanismes impliquant différentes cellules: les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les astrocytes et les neurones. Le poids des différentes voies de signalisations mises en jeu reste controversé. S’il a été particulièrement étudié au niveau de la substance grise, très peu de données expérimentales concernent la substance blanche. Le nerf optique, dans sa partie intracrânienne, est un modèle de substance blanche complètement inexploré. Le but du projet est d’analyser les bases cellulaires de l’hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique. Nous souhaitons plus précisément caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie des cellules ganglionnaires au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons 3 paramètres quantitatifs du nerf, jusqu’alors inaccessibles : la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Ceci pourra amener, dans un deuxième temps et dans le cadre d’une nouvelle demande, à utiliser cet outil pour comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une partie des animaux (44souris) recevront 3 injections intrapéritonéales rapides pour induire le modèle (1/jour pendant 3 jours). L’injection ne dure que quelques secondes. Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie gazeuse et en conditions stériles. La procédure consistera en l’implantation d’une fine lentille au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (48 animaux) recevra une unique injection virale intravitréenne de virus adéno associés (AAV) dans un seul œil, sous anesthésie gazeuse. La procédure d’injection dure environ 10 minutes. Les animaux seront observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les sessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants en intra veineux. Durant les sessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les sessions d’imagerie, une partie des animaux (12 souris) est euthanasiée par une méthode réglementaire sous anesthésie pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont euthanasiés.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’injection intrapéritonéale pourra induire une perte de poids (rarement supérieur à 10% du poids initial, après le dernier jour d’injection) ainsi qu’un stress et une douleur au point d’injection. L’acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale au niveau du site opéré (crâne) ainsi qu’une douleur durant les trois jours suivants la chirurgie. L’injection de virus adéno associés dans le vitré de l’œil peut entrainer une inflammation de l’œil. L’imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l’expérience particulièrement chez l’animal éveillé. Il existe un faible risque de mauvaise réaction à l’anesthésie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l’exactitude des données obtenue en imagerie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique puisqu’il qu’il n’y a plus de flux sanguin sur les modèles in vitro.
2. Réduction
Le nombre de 132 animaux a été estimé sur la base d’expérimentations similaires effectuées précédemment au sein de notre équipe ainsi que par des logiciels de statistique. Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l’utilisation d’animaux autant que possible en observant plusieurs fois les mêmes animaux et en développant des analyses statistiques robustes pour une interprétation fiable des résultats.
3. Raffinement
Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : – en améliorant les conditions expérimentales par l’administration d’anesthésiques et analgésiques chaque fois que nécessaire – en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d’éviter toute souffrance à l’animal et son euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge – en garantissant des conditions d’hébergement appropriées aux animaux (ajouts d’enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) – en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la structure du bien être animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il n’existe pas de méthode alternative possible à l’utilisation d’animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures. Les souris sont identifiées par tatouage aux pattes et génotypées après une biopsie de l’extrémité distale de la queue.