Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-12-13 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-900044)
7 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie, leur utérus étant transpercé par un capillaire de verre pour injecter le cerveau de chaque embryon, puis les nouveau-nés sont tués à sept jours pour prélever leur cerveau. L’objet est d’étudier des gènes de modification des ARN de transfert dans le développement du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et met en avant l’efficacité de la souris, qui porte environ huit embryons par portée.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le cortex cérébral est la partie superficielle du cerveau qui permet à l’homme d’effectuer des tâches complexes. Il est composé de différents types de cellules cérébrales spécialisées dont les neurones. Au cours du développement du cerveau chez l’embryon, un seul groupe de cellules progénitrices génère tous les types de cellules du cerveau qui doivent se former au bon endroit et au bon moment pour avoir un cerveau fonctionnel. Les processus qui régulent la création des différentes cellules du cortex ne sont pas encore entièrement connus et des perturbations dans ces processus pendant le développement conduisent à des maladies rares appelées troubles du neurodéveloppement. Notre équipe souhaite comprendre les processus qui régulent le développement du cortex cérébral et la production des différents types de cellules du cortex. Parmi les processus impliqués, le décodage de l’information génétique des cellules en une succession d’acides aminés formant les protéines, apparait comme un élément clé et sa molécule adaptatrice responsable du décodage, l’ARN de transfert (ARNt) comme une molécule décisive. Pour être pleinement actifs, les ARNt doivent être modifiés puis chargés avec leurs acides aminés. Ces modifications sont effectuées par des molécules appelées enzymes. A ce jour, 84 gènes de modification et 20 gènes de chargement des ARNt ont été identifiés. L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication des enzymes de modification et de chargement des ARNt dans le développement cortical et d’identifier quelles enzymes influencent la génération et la diversité des cellules du cortex. Pour ce faire, nous allons utiliser une nouvelle approche chez la souris qui permet d’inactiver une des enzymes de modification des ARNt dans chaque cellule progénitrice du cortex chez l’embryon au début du développement du cortex et d’analyser les effets 7 jours après la naissance lorsque le développement des neurones est terminé. L’intérêt de cette approche est que nous pourrons tester toutes les enzymes de modification des ARNt en même temps chez un même embryon et observer les effets sur les cellules individuellement. Pour chaque cellule, nous identifierons quelle enzyme de modification a été inactivée et les conséquences sur la cellule. Ainsi, nous pourrons déterminer quelles modifications de l’ARNt sont importantes pour la génération et le développement des cellules du cortex.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet permettra de mieux comprendre le rôle des molécules adaptatrices de la traduction, les ARNt, et de leurs modifications et leur chargement dans le développement du cortex cérébral. Il permettra d’identifier les gènes de modification des ARNt importants pour le développement du cortex et dont l’inactivation pourrait conduire à des malformations du cerveau. L’identification des tels gènes permettra de proposer de nouveaux gènes candidats dans la recherche des causes génétiques chez les patients atteints de malformations du développement cortical. Enfin, la compréhension des mécanismes pathologiques responsables peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les femelles gestantes vont subir une injection d’anti-douleur (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (consistant en l’ouverture de l’abdomen : laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon pour une durée de 1 à 10 secondes par embryon). La durée totale de la chirurgie n’exèdera pas 45 minutes. Les femelles gestantes seront par la suite placées dans des cages isolées puis avec leur portée jusqu’à la mise à mort des souriceaux. Les embryons au stade embryonnaire E12.5 vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin (entre 1 et 10 secondes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits (site d’injection dans le dos entre les omoplates avec une aiguille très fine et cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Les femelles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait, privées de congénères. L’isolement sera uniquement physique (pas visuel, olfactif et auditif) car les souris verront, sentiront et entendront leurs congénères. Les embryons à 12.5 jours de gestations vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin. Depuis 8 ans que nous effectuons ce type d’injection dans le cerveau au laboratoire, nous n’avons pas observé de phénotypes dommageables chez les souris après la naissance ou à l’âge adulte.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles gestantes sont herbergées jusqu’à la mise à mort des nouveau-nés. Les nouveaux-nés sont herbergés 7 jours, puis mis à mort pour collecter leur cerveau.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les conséquences de l’inactivation de gènes sur le développement embryonnaire du cortex. Le projet vise à utiliser une approche groupée in vivo afin d’analyser les effets de la perturbation des différents gènes de modification et de chargement des ARNt simultanément sur le développement du cortex et sur la quantité et la diversité des neurones générés. Cette approche a déjà été utilisée chez la souris au cours du développement en 2020 par Jin et ses collaborateurs pour évaluer la fonction de 35 gènes candidats de troubles du spectre autistique et de retard du neurodéveloppement et elle a permis d’identifier des types cellulaires et des gènes communément affectés, justifiant la pertinence de cette approche et sa faisabilité dans le modèle murin.
2. Réduction
Les approches conventionnelles pour étudier les effets de l’inactivation d’une enzyme sur le développement du cerveau requiert de générer une lignée de souris pour chaque enzyme analysée, ce qui demande de produire un grand nombre d’animaux pour chaque enzyme. Nous avons choisi une stratégie qui nous permet d’utiliser une seule lignée de souris pour tester les effets de l’inactivation d’environ 30 enzymes simultanément dans un même embryon et donc de diminuer considérablement le nombre d’animaux manipulés. De plus, nous avons choisi de générer la lignée de souris utilisée sur un fond génétique présentant un faible taux de cannibalisme des nouveau-nés et un nombre important de nouveau-nés par portée permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux manipulés. Nos croisements de souris seront faits de manière à utiliser 100% des embryons générés pour les expériences. Nous avons prévu une phase de formation à l’injection dans le cerveau des embryons à 12.5 jours de gestation de 2 expérimentateurs sous la supervision de l’assistante ingénieure de l’équipe qui a acquis une très bonne maitrise de cette technique chirurgicale au long de ces 8 dernières années. L’objectif de cette formation est d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons afin de limiter le nombre de femelles gestantes manipulées. Pour cela, nous avons également investi dans un système de loupe équipé d’un écran afin de mieux visualiser les embryons et ainsi d’optimiser les conditions d’injections. De plus, nous utiliserons des nouveau-nés d’autres expérimentateurs de l’animalerie pour optimiser la collecte et la préparation des cellules au lieu d’élever des souris supplémentaires. Enfin, nous exploiterons les données publiées et l’analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié d’animaux pour notre étude et ses analyses statistiques. Les analyses statistiques sont effectuées par l’analyse différentielle au niveau des cellules individuelles. En optimisant le protocole au mieux de nos capacités, nous serons en mesure d’obtenir des cellules de haute qualité et en quantité suffisante pour chaque animal utilisé, augmentant ainsi la taille de notre échantillon pour les tests statistiques tout en maintenant un nombre d’animaux utilisés à un faible niveau.
3. Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien-être des animaux utilisés pour ce projet. Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Des nids et des tunnels seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Au début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d’un anti-douleur 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation, les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la déshydratation par du gel pour les yeux. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes maximum sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie gazeuse. Un anti-inflammatoire est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relai de l’analgésie pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les femelles gestantes sont euthanasiés immédiatement et les embryons sont sortis de leur sac utérin et mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’approche utilisée a été mise au point chez la souris et dans le cerveau d’embryons de souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par femelles gestantes rend cette méthode efficace. De plus, la technique utilisée nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà existantes. Enfin, les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets de l’inactivation des gènes analysés dans le développement cortical.