Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 20/12/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-166046)
57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une athérosclérose, elles reçoivent une alimentation enrichie en cyanate de sodium, des injections d’une sonde fluorescente et des épilations sous anesthésie répétée, avant d’être tuées pour prélever aorte, sang et queue. Le projet étudie l’effet du vieillissement des protéines sur la paroi des vaisseaux. Le porteur affirme qu’une étude in vitro seule ne peut représenter les mécanismes d’un « organisme entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Avec 17,7 millions de décès en 2017, les pathologies cardio-vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. C’est donc un enjeu de santé publique de mieux comprendre et caractériser les causes de ces maladies. L’athérosclérose est une maladie complexe touchant principalement les artères de moyen et gros calibre marquée par une modification importante de la structure des vaisseaux sanguins et caractérisé par la formation de plaques. Au cours du temps, ces plaques s’épaississent et gênent la circulation sanguine. Elles peuvent également se rompre, entraînant alors la formation d’un caillot provoquant des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus du myocarde, ou des ischémies périphériques. En vieillissant, les protéines subissent des modifications pouvant affecter leurs structures et leurs fonctions. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle du vieillissement des protéines présentes au niveau des vaisseaux sanguins. En effet, les vaisseaux sanguins sont principalement composés de cellules et de protéines. Lors du processus athérosclérotique, ces cellules vont se déplacer autour de la plaque afin de l’isoler. Notre projet vise à déterminer si le vieillissement des protéines joue un rôle dans le remodelage du vaisseau et sur le déplacement des cellules permettant d’isoler la plaque de la circulation sanguine au cours du développement de l’athérosclérose. Ce projet est multisite et se déroulera dans deux étuablissements utilisateurs.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettra de faire progresser les connaissances scientifiques sur les pathologies cardiovasculaires et de mieux comprendre l’impact du vieillissement des protéines sur le remodelage de la paroi des vaisseaux dans le développement, l’évolution et les complications de l’athérosclérose afin de trouver, in fine, de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but de mieux diagnostiquer et donc mieux traiter les pathologies cardiovasculaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Voici toutes les interventions auxquelles les animaux seront soumis : – Anesthésie générale : Lors de l’injection de la sonde fluorescente et lors des acquisitions d’imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. L’état d’anesthésie sera obtenu par inhalation d’isoflurane à 4% et maintenu par inhalation d’isoflurane 2%. – Injection au niveau de la veine de la queue : Injection d’une sonde fluorescente pour l’acquisition des images au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette injection se fera sur animal anesthésié par isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (9 souris X 3 groupes X 1 intervention = 27 fois) et deux fois pour chaque souris pour la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 interventions = 42 fois). – Épilation : L’épilation est nécessaire pour l’acquisition des images à l’échographe et au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette intervention rapide se fera à l’aide d’une crème dépilatoire pour peaux sensibles sur le thorax et l’abdomen de la souris. Ce geste sera réalisé sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%) sur une plateforme chauffante afin de maintenir la température de l’animal. Ce geste sera réalisé trois fois pour chaque souris de la procédure 1 (c’est-à-dire : 9 souris X 3 groupes X 3 épilations = 81 fois) et deux fois pour chaque souris de la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 épilations = 42 fois) – Injection intrapéritonéale : L’euthanasie nécessite l’injection d’un agent anesthésique. Ce geste sera réalisé sur les animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (c’est-à-dire 27 fois au total) et une fois pour chaque animale pour la procédure 2 (c’est-à-dire 21 fois au total). Par souris : Chaque souris de la procédure 1 subira : 1 injection au niveau de la veine de la queue, 3 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2. Chaque souris de la procédure 2 subira : 2 injections au niveau de la veine de la queue, 2 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’alimentation supplémentée en cyanate de sodium et l’injection de la sonde fluorescente ne produisant pas d’effet toxique chez les animaux. Voici la liste des nuisances attenus : -Stress au moment du transport (5,3km pour 11 minutes de trajet) – Stress au moment de l’anesthésie et de son réveil, le stress d’une anesthésie dure en général quelques minutes avant l’endormissement et au réveil de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Après la mise à mort des animaux, le sang sera prélevé au niveau de l’aorte afin d’évaluer la quantité d’homocitrulline (produit de carbamylation) retrouver, les aortes thoraciques seront récupérées afin d’étudier la rigidité des vaisseaux via l’utilisation d’un microscope à force atomique, puis les compositions cellulaire et protéique des aortes et des plaques d’athéromes seront étudiées via des techniques histologiques et immunohistochimiques. La queue des animaux sera également prélevée afin d’en analyser le taux de carbamylation du collagène.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous travaillons actuellement sur un modèle in vitro avec des cellules provenant d’aortes humaines et murines cultivées sur du collagène carbamylé ou non, mais une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques mis en jeu au niveau d’un organisme entier et les approches informatiques in sillico ne permettent pas à ce jour de mimer le fonctionnement de l’organisme entier et sa réaction face au traitement. Ainsi, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle animal, puisque les résultats obtenus avec cette approche globale in vivo seront complémentaires à nos résultats in vitro et permettront d’apporter une réponse complète à notre hypothèse. Nous sommes actuellement les seuls à utiliser ce modèle animal (modèle carbamylation + athérosclérose), nous ne pouvons donc pas faire de projet commun afin de réutiliser des animaux inscrits dans une procédure d’un autre projet.
2. Réduction
Nous avons décidé de faire deux procédures, dont une 1ère en étude préliminaire avec peu de souris (9 par groupes) avec une approche de « Go/no go » pour notre seconde procédure. En effet, la première procédure servira à confirmer une bonne démarche expérimentale et définir plus précisément les différents temps d’acquisitions pour la seconde procédure. Nombre de souris totales pour la procédure 1 : 9 souris X 3 groupes = 27 souris. Pour la seconde procédure, nous n’avons aucune donnée préliminaire nous permettant de calculer la puissance statistique de notre expérience via le logiciel GPower. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire en 1ère procédure, afin d’avoir la possibilité de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en évitant d’utiliser beaucoup d’animaux pour affiner la cinétique de la procédure. De plus, les données issues de la seconde procédure viendront compléter les données issues de la première aux points de la cinétiques les plus intéressants pour atteindre une puissance statistique suffisante. Après avoir analysé les données issues de la 1ère procédure, nous pourrons alors calculer la puissance statistique afin de définir le nombre optimal d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Nous utiliserons au maximum 10 souris par groupe pour la seconde procédure (avec une potentielle diminution du nombre de souris en fonction des résultats issus de la 1ère procédure). Nous nous engageons à analyser les résultats de la première procédure et de calculer notre puissance statistique avant de commander les animaux de la deuxième procédure afin d’en utiliser le moins possible. Nombre maximal de souris au total pour la procédure 2 : 7 souris X 3 groupes = 21 souris. L’utilisation de souris exclusivement mâles, nous permet également de réduire le nombre d’animaux nécessaires puisqu’utiliser des animaux du même sexe permet de s’affranchir d’une variable biologique supplémentaire et de limiter l’hétérogénéité de nos résultats.
3. Raffinement
Quotidiennement : Les cages transparentes seront équipées de divers équipements d’enrichissement (tubes de jeu, niche, papier, bâton à rogner, coton …) afin de réduire l’ennui et de diminuer le stress en stimulant l’activité et en procurant un sentiment de sécurité à l’animal. Une surveillance quotidienne sera mise en place par une collaboration étroite avec les animaliers afin de prévenir et de traiter toutes manifestations de douleur ou de stress chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de 30x40cm à raison de 5 souris par cage au maximum. Les animaux seront séparés selon leur groupe dans différentes cages (2 par groupe). Nous identifierons les animaux à l’aide de traces réalisées au marqueur indélébile au niveau de la queue. Le tableau présenté en Annexe 3 présente une grille de score adaptée qui sera suivie afin d’identifier des douleurs potentielles. Étape 1 : Le traitement ne produira pas de nuisance à l’animal. Afin de vérifier la bonne hydratation des souris, les biberons seront pesés tous les jours ouvrés et changés tous les deux jours. Étape 2 & 3 : L’utilisation du tomographe moléculaire à fluorescence (FMT) et de l’échographe nécessite un transport des animaux sur le campus Moulin de Housse (où se trouvent les appareils). Une surveillance accrue sera effectuée pendant le trajet et un morceau de pomme sera placé dans les cages afin de permettre aux animaux de continuer à s’hydrater et s’alimenter. L’utilisation ces appareils nécessite également une anesthésie générale de l’animal avec de l’isoflurane (4% pour l’induction et de 2% pour le maintien), une surveillance accrue sera effectuée pendant l’anesthésie, et l’état d’endormissement de l’animal sera confirmé par pincement des espaces interdigitaux. Enfin pour un réveil optimal des animaux concernés, l’animal sera placé sous lampe chauffante puis surveillé. Afin d’éviter le stress des animaux aux changements d’environnement, les souris seront emmenées sur le site Moulin de la Housse 24h avant l’acquisition pour qu’elles découvrent et qu’elles s’habituent aux salles de manipulation, afin que le jour de la manipulation il n’y ait pas de biais sur nos résultats. Lors de l’analyse à l’échographe, les animaux seront placés sur une plateforme chauffante composée de capteurs permettant de suivre les paramètres vitaux. Ces paramètres (fréquence respiratoire, électrocardiographie et la température corporelle de l’animal) seront surveillés pendant toute la durée de l’acquisition.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle choisi est le modèle murin dont le gène de l’apolipoprotéine E est non fonctionnel. Ce modèle est un modèle de référence pour l’étude de l’athérosclérose qui est très bien caractérisé. En effet ces souris développent la maladie sans avoir besoin de leur apporter un régime gras (non compatible avec l’utilisation du FMT puisqu’il faut un régime sans chlorophylle et qui rajouterait une variable supplémentaire à nos expériences et donc un groupe témoin supplémentaire). Nous commanderons des souris à l’âge de 4 semaines, c’est-à-dire des jeunes sevrés. Nous sommes obligés de commander des souris non adultes puisque ces souris mâles développent spontanément des plaques d’athéromes à partir de 7 semaines de vie. Nous n’avons pas le choix de commander des animaux au stade « jeunes sevrés » puisque nous voulons étudier l’impact de la carbamylation des protéines sur le développement des phases précoces de l’athérosclérose, il faut donc induire la carbamylation des protéines avant le développement de la pathologie. Toutes les expérimentations et les mises sous anesthésies se feront sur un animal adulte (âgé de 9, 13 et 16 semaines pour la procédure 1 et âgé de 9 et 13 ou 16 semaines pour la procédure 2).