Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/03/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-518887)
550 souris génétiquement modifiées pour n’exprimer Mecp2 que dans les neurones catécholaminergiques vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles peuvent développer des apnées, de l’hyperventilation, des crises d’épilepsie, une perte importante de poids et une mobilité réduite, et passent par un protocole d’induction de stress de deux fois trente minutes, le test de Barnes, le rotarod, l’open field, le labyrinthe surélevé et la boîte clair-obscur, un petit étant retiré du nid pour éprouver la réponse de la mère. L’ampleur réelle de ces atteintes reste inconnue, puisque caractériser le phénotype de la lignée est précisément l’objet du projet. Le porteur affirme que ce modèle, couplé à un modèle de surexpression ciblée, est « indispensable » pour développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie neurodéveloppementale rare d’origine génétique. Dans la majorité des cas, la maladie est liée à une mutation du gène Mecp2 qui code pour un facteur de transcription possédant un rôle majeur dans le développement du système nerveux central. La pathologie touche majoritairement les filles et entraîne un polyhandicap sévère qui affecte considérablement la qualité de vie des patientes. Parmi les symptômes, on retrouve notamment une perte/non acquisition des fonctions motrices volontaire (marche/préhension) s’accompagnant de stéréotypies manuelles. On retrouve également des troubles des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation. Les patientes souffrent aussi d’une déficience intellectuelle, de crises d’épilepsie et de troubles variés affectant le sommeil et l’alimentation. De précédentes études réalisées chez des patientes et des modèles murins de la pathologie ont mis en évidence l’existence d’un déficit en certains neurotransmetteurs (dopamine, noradrénaline, sérotonie) largement impliqués dans les processus d’apprentissage et de réponse au stress. Afin d’identifier la part de des symptômes du RTT imputables aux déficits catécholaminergiques, nous souhaitons faire exprimer la protéine Mecp2 dans les neurones catécholaminergiques (exprimant la dopamine, l’adrénaline et la noradrénaline) des souris déficientes en Mecp2. Les animaux de cette étude seront analysés d’un point de vue phénotypique (survie, poids corporel, fonctions respiratoires/motrices/cognitives, anxiété, réponse au stress), histologique et moléculaire (prélèvements d’organes).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif de ce projet est d’apporter une meilleure compréhension des relations entre Mecp2, le système catécholaminergique et l’état pathologique des animaux modèles du syndrome de Rett. Cela devrait nous permettre de déterminer la part des symptômes du RTT imputable à ces déficits catécholaminergique. Cette étude devrait par la suite permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le système catécholaminergique et pouvant avoir un intérêt pour le traitement du RTT.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à différentes interventions: – phénotype neurologique dommageable (sur la durée de vie de l’animal), – retrait d’un petit du nid (stress pour la femelle et son petit): moins de 30s, – protocole d’induction de stress (deux fois 30 minutes), anesthésie gazeuse (deux fois 10 minutes), test de Barnes (2 minutes), Rotarod (5 minutes), open field, elevated plus maze, dark-light box (10 minutes), anesthésie profonde par injection (30 se pour l’injection) puis perfusion intracardiaque terminale
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nos souris Mecp2y/- pTh-Mecp2 présentent une absence d’expression de Mecp2 dans toutes les cellules à l’exception des neurones catécholaminergiques. Étant donné que la déficience totale de Mecp2 entraîne l’apparition d’un phénotype dommageable mimant le RTT, nous nous attendons à observer chez notre modèle d’intérêt un phénotype moins sévère mais restant pathologique en comparaison à des souris sauvages. Les potentiels effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : – une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation – une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité – une sensibilité accrue au stress – une perturbation du comportement maternel chez les femelles – une perte importante de poids corporel – des crises d’épilepsies. La détermination précise du phénotype de notre modèle est un des objectifs de ce projet de recherche. En parallèle, les tests phénotypiques réalisés pour caractériser nos lignées sont susceptibles de générer une douleur ou un stress chez nos animaux. Certains animaux seront également anesthésiés pour la réalisation de prélèvements sanguins.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous ne pouvons pas expérimenter chez l’être humain malade atteint d’un syndrome de Rett. Il est donc nécessaire d’avoir recours à un modèle d’étude de la pathologie. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l’espèce humaine, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle animal, car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le seul modèle de mammifère disponible à l’heure actuelle pour nos travaux est le modèle souris transgénique dans lequel Mecp2 est manipulé. Ce modèle est utilisé pour mieux comprendre la pathologie et comme modèle pré-clinique afin de développer de nouveaux traitements.
2. Réduction
La variabilité interindividuelle est réduite par l’utilisation de souches de souris fixées génétiquement. Une analyse de puissance statistique est réalisée en amont de chaque procédure afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Une fois les expérimentations achevées, des test statistiques appropriés permettront de valider ou non les résultats obtenus. Les expérimentations seront initalement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenus feront l’objet d’analyse statistique préliminaire en fonction du résultats desquelles : – les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes – le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble existée mais ne ressort pas suffisament pour atteindre la significativité
3. Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage (afin de réduire la douleur et le stress des animaux). Les animaux sont hébergés, en groupes, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température (21°C-23°C), la luminosité (cycle 12h jour / nuit), l’environnement sonore et l’hygrométrie sont contrôlés. Cet hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Nos souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Dans le but de limiter le stress des animaux lors des expérimentations, ceux-ci seront préalablement habitués à l’expérimentateur lors de session de « handling ». Une période d’habituation aux dispositifs de tests sera également prévue. Lors des expérimentations – qui seront réalisées par des personnels formés – le nombre de personnes présentes dans la pièce sera limité au maximum pour ne pas perturber les animaux. De plus, afin de limiter le stress des animaux, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie. En parallèle, l’état général de nos animaux sera surveillé quotidiennement de manière à pouvoir intervenir dans les plus brefs délais en cas d’atteinte des points limites définis.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Seule la souris permet actuellement de disposer facilement, rapidement et à moindre coût, d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L’intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l’espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle déficient en Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche sur le syndrome de Rett, et est largement caractérisé dans la littérature. L’utilisation de ce modèle, couplé au modèle de surexpression ciblée de Mecp2 est indispensable pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nos animaux seront inclus dans la procédure de caractérisation phénotypique à partir de 30 jours de vie (P30), stade auquel les premiers symptômes de la pathologie apparaissent chez la souris Mecp2-déficiente.