Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/04/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-513126)
Baguées à l’oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d’une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu’au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l’incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d’une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d’une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l’identification d’une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L’objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l’atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L’étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l’élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l’atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d’option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour l’ensemble des procédures, l’identification des animaux nécessitera la pose d’une bague à l’oreille et d’une biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d’une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d’une deuxième injection intrapéritonéale d’une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : – une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l’âge de 3 mois, – une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l’animal (autour de 10 à 14 mois). L’identification des animaux (pose d’une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d’intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d’intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l’utilisation de l’animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l’ensemble de l’organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d’étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d’établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
2. Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d’utiliser le minimum d’animaux nécessaires à ce projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
3. Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l’animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l’eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L’environnement de l’animal sera enrichi par ajout d’un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l’animal de se faire un nid à l’abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l’animal de ronger) dans chaque cage.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l’homme, permettant dans la mesure du possible d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions valables pour l’homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d’obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : – stade correspondant à l’atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l’extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu’elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) – stade d’apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie – stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) – stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)