Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/04/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-888285)
108 souris, dont un tiers privées du gène kctd11 et un tiers porteuses d’une seule copie, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à 18 mois pour le prélèvement de leurs nerfs et de leur moelle épinière. À 6, 12 et 18 mois, chacune passe quatre tests, locomotion et équilibre, démarche, force musculaire mesurée en la tenant par la queue et en tirant, sensibilité de la plante des pattes à un filament appliqué jusqu’à cinq fois. À 12 et 18 mois s’ajoute la mesure des vitesses de conduction nerveuse, par aiguilles plantées à travers la peau des pattes sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique disposer de modèles cellulaires dérivés de cellules de patients et les utiliser, puis conclut que le remplacement reste impossible parce que ces modèles ne reconstituent pas le système nerveux périphérique complet.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet a pour but d’évaluer si le modèle murin dit « knock-out » (KO), dans lequel nous avons supprimé le gène kctd11, est un bon modèle pour la maladie humaine, causée par des mutations dans ce même gène KCTD11. Il s’agit de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, une maladie caractérisée par une dégénérescence progressive des nerfs du Système Nerveux Périphérique. Nous étudierons l’état des nerfs des souris KO en comparaison à des souris normales, grâce à des analyses de la structure des nerfs, à la mesure des vitesses de conduction nerveuse, ainsi qu’à l’évaluation des capacités locomotrices des souris, à différents âges (6-12-18 mois). Disposer de ce modèle va nous permettre de mieux comprendre comment la perte du gène KCT11 aboutit à une neuropathie et à définir des traitements pour la maladie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce modèle de souris présente des caractéristiques de la maladie CMT et a le potentiel d’être un nouveau modèle de la pathologie afin de développer des traitements futurs pour les patients atteints de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront quatre tests comportementaux, peu ou pas invasifs, à trois âges différents (6, 12 et 18 mois). Ces tests visent à tester les fonctions locomotrices des souris et à repérer des troubles de la sensibilité (ex: toucher, douleur). Les 4 tests sont listés ci-dessous: 1) un test pour mesurer la locomotion et l’équilibre des souris. Ce test se déroule sur 2 jours : 1er jour pour habituation, 2ème jour pour mesure. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). 2) un test pour évaluer la démarche de l’animal. Durée : 15 minutes. 3) un test pour évaluer la force musculaire des souris. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). Il est réalisé pour les pattes avant seulement puis répété pour les pattes arrière seulement. 4) un test pour analyser la sensibilité des souris à un stimulus mécanique au niveau des dessous des pattes. Durée : 10 minutes (temps de repos inclus). A 12 et 18 mois, on ajoute un cinquième test, qui sert à mesurer les vitesses de conduction des nerfs, par pose d’électrodes (aiguilles), sans chirurgie, au travers de la peau, au niveau des pattes inférieures. Nous réaliserons 3 mesures pour chaque patte, soit 6 mesures au total par animal. L’intervention dure environ 10-15 minutes par animal. A chaque âge, l’ensemble des tests, pour l’ensemble des souris, s’effectuera sur 3 semaines : La 1ère semaine : test 1 (2 jours) et test 3 (2 jours). La 2ème semaine : test 2 (4 jours) La 3ème semaine : test 4 (2 jours) et mesure des vitesses de conduction nerveuse (2 jours) (à 12 et 18 mois uniquement).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les tests qui sont prévus dans ce projet ne sont pas ou peu invasifs. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus invasif est la mesure des vitesses de conduction nerveuse. On pose des électrodes au niveau des pattes inférieures. La pose des électrodes est non invasive (sans chirurgie) :les électrodes sont posées à travers la peau. Ce test n’est réalisé qu’à deux âges (12 et 18 mois). Pour éviter toute douleur ou inconfort, ce test est réalisé sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont maintenus au chaud grâce à un coussin chauffant et une couverture de survie. Enfin, afin d’identifier et de génotyper les animaux en procédure, ces derniers subiront la pose d’une puce RFID (puce électronique que l’on peut ensuite scanner à l’aide d’une scannette pour identifier facilement les animaux) et un petit poinçon à l’oreille à l’âge de 4 semaines. Ceci nécessite une contention des animaux de quelques secondes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de l’expérimentation, les animaux seront âgés (18 mois) et nous avons besoin de récupérer leurs nerfs et la moelle épinière pour étudier quels sont les effets de la maladie sur la structure de ces tissus à long terme. Ainsi, les animaux seront mis à mort pour prélever ces tissus.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique du Système Nerveux Périphérique, composé par l’ensemble des nerfs craniens et les nerfs « spinaux »qui servent à innerver tous les muscles du corps pour les faire bouger ou à transmettre au cerveau, à partir des extremités, une information de type douleur par exemple. Chez l’homme, le Système Nerveux Périphérique est inaccessible et impossible à étudier. L’utilisation de modèles cellulaires, à base de cellules souches adultes, dérivées de cellules (peau ou sang) prélevées chez un patient, peut dans certaines circonstances, constituer une bonne alternative, et nous les utilisons. En effet, nous savons, à partir de ces cellules souches, fabriquer les neurones du Système Nerveux Périphérique, mais pour l’instant nous ne parvenons pas à reconstituer, en tube, le Système Nerveux Périphérique complet. Ils sont un modèle extrêmement simplifié, qui ne permet pas notamment de reproduire la complexité du Système Nerveux Périphérique et de ses interactions avec les muscles. Il existe un autre modèle in vitro de la maladie, mais qui est obtenu à partir d’embryons de rongeurs (rat ou souris, génétiquement modifiés ou non) et qui donc nécessite l’utilisation des animaux. Pour finir, nous travaillons sur des anomalies du système neuromusculaire et devons donc pouvoir étudier la locomotion et la sensibilité à la douleur chez des animaux vivants. C’est pourquoi, malgré l’existence de modèles cellulaires alternatifs, que nous utilisons pour réduire et raffiner, le remplacement n’est pas possible et cette étude nécessite l’utilisation de modèles souris. Le passage au modèle animal est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
2. Réduction
Nous aurons trois groupes d’animaux (mutés (KO), hétérozygotes pour la mutation (HET) et sauvages (WT)). Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation du projet est de 36 animaux par groupe. Ce nombre a été calculé, par un test statistique, au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur les paramètres que nous allons évaluer.
3. Raffinement
Le phénotype des souris est très léger et leur survie est identique à celle des animaux contrôles.Il n’y a aucune chirurgie dans ce projet. Les tests sont décrits au paragraphe 5.6.1. Lors de chaque test, la salle est réservée et seule la personne expérimentatrice est présente dans la salle. Pour tous les tests, les animaux sont habitués au minimum 30 min dans la pièce expérimentale, avant le début de l’expérience. Après l’expérience, (et un temps de repos selon les tests), les souris sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Afin de limiter le stress des animaux durant l’expérimentation, on procède toujours à une habituation, en particulier pour les tests 1 et 2. Lors de la manipulation, nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. L’habituation permet aux souris de limiter le stress qu’elles pourraient ressentir.Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, 30 minutes avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus stressant est le test de mesure des vitesses de conduction nerveuse. Il sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’anesthésie sera suffisamment profonde, les animaux seront placés sur un coussin chauffante pour éviter l’hypothermie. Une petite couverture de survie pourra être placée sur l’animal pour bien maintenir sa température corporelle. Après les mesures, les souris sont maintenues sur le coussin chauffant, recouvertes d’une couverture de survie, jusqu’au réveil, puis placées dans une cage une dizaine de minutes sous surveillance. Lorsqu’elles sont bien réveillées, elles sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Tout le long de la procédure, des points limites sont définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption définis.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le laboratoire a identifié un nouveau gène muté dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), une maladie génétique des nerfs périphériques (nerfs qui servent à faire bouger les muscles), qui entraine des troubles de la locomotion et de la sensation (toucher, douleur). C’est une maladie neurologique progressive aujourd’hui incurable. A l’heure actuelle, le rôle de ce gène dans le déclenchement de la maladie n’est pas bien compris, mais cette compréhension est nécessaire pour pouvoir mettre au point des traitements. Malgré le développement de modèles cellulaires alternatifs, nous avons besoin d’étudier un modèle animal, dans lequel le gène incriminé est invalidé, pour regarder quelles sont les anomalies des nerfs de ces souris, comprendre les mécanismes par lesquels l’invalidation du gène mène à ces anomalies, et tester des traitements qui permettent de supprimer les anomalies. le choix d’un animal dans lequel le gène est invalidé est justifié par le fait que chez les patients, les mutation qui causent la maladie aboutissent à une perte de fonction de la protéine représentée par le gène muté. Les expériences proposées dans ce projet sont réalisées à partir de mois et jusqu’à 18 mois, car la neuropathie, dont sont atteints les patients mutés pour le gène, est une maladie neurologique lentement progressive. Il faut donc pouvoir étudier des animaux agés. De plus à plus long terme, avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme, il sera nécessaire de tester les traitements sur un modèle murin.