Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-06-25 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-762210)
Amputés d’un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d’imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d’exclusion, l’objectif étant de vérifier qu’une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches « largement non-invasives », tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd’hui une importante létalité.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d’une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n’a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d’un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de mieux définir le rôle d’une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un prélèvement d’un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D’autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l’utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l’expérience, les tests d’ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l’animalerie. A l’heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d’animaux par procédure.
3. Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l’apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d’image nécessaire au cours des procédures d’imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d’acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l’anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l’existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d’observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).