Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-07-08 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-521503)
Les souris de ce projet portent une mutation qui les prive de dystrophine et ont été croisées avec des lignées immunodéficientes pour qu’elles acceptent des cellules humaines sans les rejeter. 665 d’entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une irradiation locale sous anesthésie de vingt et une minutes au maximum, une injection d’agent de régénération dans le muscle tibial antérieur, puis une injection de cellules humaines au même endroit, une partie passant en plus quarante-cinq minutes en imagerie. Le porteur indique que l’irradiation peut provoquer un œdème, une pelade ou des ulcérations gênant les mouvements, et justifie la mise à mort de toutes les souris un mois après la greffe par la « nécessité » de retirer entièrement les muscles injectés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet est de comparer l’efficacité de la greffe de différents types de cellules dans la régénération musculaire, ce qui permettra ultérieurement de choisir le meilleur candidat pour de futurs essais cliniques dans le domaine des myopathies. Ce projet répondra à des questions scientifiques et représente en même temps une recherche pré-clinique. La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le projet comporte deux étapes : la première consiste à mettre au point et standardiser la meilleure procédure expérimentale adaptée à nos modèles à l’aide d’études pilotes basées sur l’expérience antérieure et la bibliographie, et la seconde consiste à tester l’efficacité de différents types cellulaires. Pour faciliter le transfert à la clinique humaine, seules des cellules humaines seront utilisées, ce qui nécessitera l’utilisation d’animaux immunodéficients capables de tolérer ces greffes sans rejet immunologique. Ces animaux sont des souris modèles de la Dystrophie musculaire de Duchenne. Les explorations seront concentrées sur les muscles traités afin de classer l’efficacité des traitements étudiés. Les résultats permettront d’évaluer la faisabilité, d’affiner la logistique et d’orienter vers un projet clinique de plus grande ampleur.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible des dystrophies musculaires. Sur le plan technique, une fois établi le « meilleur » candidat cellulaire il sera possible d’améliorer les paramètres de la greffe. Ces données permettront de mettre en place une nouvelle génération d’essais de thérapie cellulaire dans l’indication de la dystrophie musculaire de Duchenne, pour améliorer ou stabiliser la qualité de vie des patients. Les bénéfices de ce projet sont donc attendus dans le domaine scientifique fondamental et dans le domaine clinique. De plus, basé sur la mise en place d‘une plateforme collaborative, il bénéficiera à la communauté scientifique impliquée dans la thérapie cellulaire musculaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’ensemble des actes seront effectués sur des animaux modèles de dystrophies musculaires et immunodéficients. Une première partie des animaux servira à la mise au point de la dose d’irradiation optimale (étude pilote). Les animaux seront pesés et anesthésie afin de réaliser une irradiation à différentes doses (21 minutes maximum) suivi d’un maintien de deux semaines maximum. Une seconde partie des animaux sera utilisé pour la mise au point de la régénération musculaire (étude pilote). Les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de comparer l’efficacité de deux agents de régénération et de déterminer la dose minimale efficace, par injection localisée dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur). Cet acte est d’une durée de 5 minutes. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Enfin, une dernière partie des animaux sera impliqués dans des actes successifs après les étapes de mises au point préalable. Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie générale (21 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection unique d’agent de régénération musculaire sous anesthésie et analgésie dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur) (5 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection de cellules humaines sous anesthésie et analgésie au même site (5 minutes maximum). Si l’agent de régénération musculaire n’est pas toxique pour les cellules in vitro, une seule intervention d’injection sera réalisée le même jour. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Une surveillance sera assurée quotidiennement. Après un mois d’observation, une partie des animaux de ce groupe seront analysés par imagerie (bioluminométrie) sous anesthésie après injection d’un agent produisant à l’émission des photons qui peuvent être quantifiés, et cet acte sera d’une durée de 45 minutes. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire après le temps de maintien défini (1 mois) en fonction des besoins pour prélèvements des muscles et leurs analyses.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux utilisés sont immunodéficients, ils peuvent donc être plus sensibles aux infections. Les animaux subiront une irradiation ce qui pourra induire une brûlure dans de rares car puis une perte progressive de masse musculaire vers 6-8mois (ce délai n’est pas atteint dans la procédure expérimentale). Certaines souches d’animaux immunodéficient sont plus sensibles à l’irradiation et pourront avoir un gonflement et un oedème de la peau, une pelade, ou des ulcérations, gênant les mouvements et pouvant générer de la douleur. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Des injections intramusculaires seront réalisées ce qui peut engendrer une douleur de courte durée au point d’injection. La solution injectée pourra générer une inflammation dans les premiers jours et dans de rares cas une gêne de la mobilité.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La décision d’euthanasier tous les animaux à l’issue de la procédure a été prise lors de la rédaction du projet par les concepteurs, car il est nécessaire de prélever les muscles injectés, et ceci ne peut être fait sans l’euthanasie des animaux. Les animaux ne peuvent être ré-utilisés, la procédure nécessite l’exérèse totale des muscles injectés, notamment afin d’étudier les capacités de migration des cellules injectées.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but du projet est d’évaluer la capacité régénérative musculaire de différents types de cellules pour développer une thérapie cellulaire dans l’espoir de soigner la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Au stade où les différents candidats cellulaires sont utilisés, ils ont déjà fait la preuve in vitro de leur capacité à fusionner et à former des petites fibres musculaires. Les modèles de cultures en deux dimensions ne représentent pas l’architecture musculaire ni les capacités contractiles et ne permettent pas de renseigner les déplacements des cellules injectées. Les modèles in-vitro de mini-muscle en trois dimensions qui existent ne renferment qu’un ou deux types cellulaires et aucun modèle pathologique complexe n’est encore développé. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable, car l’étude de la régénération doit prendre en compte l’environnement physiologique, les différents types cellulaires, les signaux et le micro-environnement d’un muscle qui influencent cette capacité régénérative, particulièrement dans un organisme malade. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont immunodéficientes et permettent la prise de greffe xénogénique (d’une espèce animale à une autre). Ainsi, le modèle peut être similaire à la DMD humaine.
2. Réduction
665 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études pilotes permettront d’optimiser les conditions et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux immunodéficients sont hébergés dans une pièce dédiée de statut sanitaire contrôlé, la nourriture et la litière sont irradiées et l’eau est osmosée. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie…) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris utilisée ici est un modèle classique de la dystrophie musculaire de Duchenne. Une mutation spontanée empêche l’expression de la dystrophine. Cet animal ne présente pas de signes cliniques avant un âge avancé (15-18 mois), ni de phénotype myopathique dommageable. Pour accepter les greffes de cellules humaines sans rejet immunologique, les souris ont été croisées avec des modèles immunodéficients. Ces modèles sont stabilisés et déjà existants. L’utilisation des modèles se justifie par leur différence de réactivité immunologique, et par des différences de susceptibilté à certains traitements musculaires. Les souris seront utilisées pour les greffes de cellules à l’âge de 3 à 5 mois. Dans ces modèles, un pic spontané de dégénérescence et régénération musculaire survient à l’âge de 3 à 10 semaines. Bien que la cause exacte de ce pic ne soit pas totalement élucidée, il s’agit probablement d’une mobilisation musculaire importante et nouvelle, qui coïncide avec la période du sevrage, le changement d’alimentation, l’acquisition d’une mobilité de plus en plus importante, la croissance des membres. Pour éviter les variabilités inter-animales liées à ce pic de remaniement musculaire, nous utiliserons des animaux ayant franchi ce cap, donc après l’âge de 3 mois. Par ailleurs, au-delà de 6 mois, certains animaux peuvent commencer à développer des anticorps susceptibles de permettre un rejet chronique des greffes, et c’est encore une variabilité que nous devons éviter. Les souris étant euthanasiées 1 mois après la transplantation cellulaire, soit au plus tard vers l’âge de 6 mois, nous pouvons réaliser les greffes dans une fenêtre d’âge de 3 à 5 mois.