Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-182390)
Deux injections par semaine pendant dix semaines, chacune précédée d’une incision de deux millimètres au bout de la queue pour prélever une goutte de sang : 90 souris sur les 133 utilisées suivent ce protocole, après un régime enrichi en lipides et en sucre. Toutes sont tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour prélever leur foie et leurs autres organes. L’objectif est de tester la combinaison d’un peptide médicament et de molécules issues de cellules souches contre la stéatohépatite non alcoolique. Sur les atteintes attendues, le porteur décrit ce que produit la maladie chez le chat et chez l’être humain, note que ces symptômes n’ont pas été décrits chez les rongeurs, et ne dit pas ce que les souris elles-mêmes vont ressentir.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie du foie gras encore appelée NAFLD est une pathologie hépatique couramment retrouvé chez l’Homme, sans qu’il y ait eu d’abus d’alcool. La forme la plus grave correspond à l’accumulation de graisses associée à un dépot excessif de substances cicatritielles dans le foie, que nous résumerons sous le terme de NASH. La NASH, corrélée à l’obésité et au diabète, représente un problème majeur mondial de santé. Environ 20 % des personnes atteintes de foie gras évoluent vers la NASH, qui dans les cas les plus graves, évolue vers une cirrhose voire, vers un cancer hépatique. Acctuellement, la transplantation hépatique est le seul traitement efficace. Notre objectif principal est de combiner deux traitements pharmacologiques : un peptide médicament et de molécules bioactives (MB) issues de cellules souches. Nous prévoyons que ces deux traitements exerceront un effet complémentaire pour limiter la progression de la NASH, réparer le tissu hépatique et le rendre de nouveau fonctionnel. Ensemble, cette combinaison vise à traiter les causes profondes de la maladie en amont de la cicatrisation exacerbée, offrant ainsi une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour prévenir la progression de la NASH. Les modèles de souris reproduisent les conditions cliniques pour une compréhension intégrative de la maladie et des complications associées dans les autres organes. Ceci rend difficile de simplifier l’étude par des systèmes cellulaires. Notre modèle murin nourri avec un régime enrichi en lipides/ sucre, se rapproche de la pathologie humaine et de son évolution et sera moins de nuissances que les modèles déjà décrits dans la littérature où une perte de plus de 20% du poids corporel est décrite associée à un effet hépato-toxique. Le peptide médicament utilisé,est aujourd’hui testé chez le patient pour une autre pathologie. L’absence d’effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l’homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur la NASH. L’injection MB a été décrites dans la littérature comme ayant des effets secondaires limités chez l’homme et l’animal.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans la NASH et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie combinée chez les patients atteints de NASH et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Sur les 133 souris ulisées, 111 souris seront soumis à un régime enrichi en lipides/sucre. Parmi ces dernières, 90 seront soumis au traitement anti-NASH avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique et/ou avec les MB., sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires (100 µL maximum). Avant chaque injection, un prélèvement sanguin ( 1min max) de 10 µL au niveau de la queue (incision 2 mm) sera réalisé pour controler le niveau du sucre dans le sang.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Chez le chat, la NAFLD est associé à un jaunissement et une perte de poids sévère et à des vomissements. Ces symptomes n’ont pas été décrits à notre connaissance dans la littérature chez les rongeurs. Selon les données cliniques, la NASH ne présente pas de symptômes chez l’homme. Dans quelques rares cas, un état d’inconfort dans l’abdomen au niveau du foie, de la fatigue, une sensation générale de malaise et un vague inconfort sont décrite. Une diminution progressive de la fonction hépatique pourrait potentiellement être à l’origine de l’apparition d’un jaunissement, d’un œdème. Un état d’incofonrt de la locomotion expliquée par la prise régulière du poids de la souris pourrait etre observée. Une douleur légère de courte durée de la piqure de l’aiguille sera ressenti lors de l’evaluation de la glycémie hebdomadaire.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de chqcune des 2 procédure les animaux seront anesthésiés avant d’être euthanasiés afin de prélever leur tissus et leurs organes à des fins d’histologie ou d’autres analyses moléculaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique plusieurs organes comme la rate, le foie, le tissu adipeux, etc. Notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire pour atténuer la progression de la NASH, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui rend indispensable l’étude de ces interactions complexes. A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro fiable et adapté pour une telle étude intégrative. Cependant, nous avons réalisé des tests in vitro sur une lignée cellulaires cultivées en milieu enrichi en graisses, où nous montrons un effet protecteur du peptide médicament, et un effet réparateur des MB. Ces essais nous rendent confiants sur l’efficacité combinée du peptide et des MB sur notre modèle murin mimant la NASH. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l’effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l’étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d’analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n’existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
2. Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n= 7 souris (procedure 1) et de n = 15 souris (procedure 2). Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, les procédures seront interrompues pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Pour la procedure 2; l’expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu’en cas des points limites atteints, d’arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d’injection, quantité injectée du peptide, age des souris…) après discussion avec le comité d’éthique… voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu’en cas d’obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d’animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d’autres projets en cours ou futurs.
3. Raffinement
La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d’urine excessive des souris NASH (valable surtout en fin de procédure pour les souris NASH non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d’un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l’euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d’évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l’age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l’euthanasie, de part l’expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c’est le cas avant la date d’euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l’ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l’analyse tissulaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l’étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures.