Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-211317)
Porteuses d’une mutation qui reproduit une maladie neurodégénérative pédiatrique, les souris de ce projet servent à explorer l’accumulation de fer dans leur cerveau. 2 720 vont être utilisées, dans des procédures déclarées d’un niveau de souffrance léger : 1 360 subissent un prélèvement de sang à la queue, 1 280 une injection intrapéritonéale de piégeurs de fer ou d’inhibiteur, 560 un gavage. Le porteur qualifie de léger chacun de ces gestes, y compris l’injection de fer, et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine. Toutes sont anesthésiées puis tuées à l’issue, pour les analyses d’immunologie et les cultures cellulaires.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des sucres provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de cahines de sucres partiellement dégradés dans un compartiment de la cellule appelé lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux ayant un effet délétaire dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d’étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris mutante. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose et identifier les populations cellulaires touchées dans ce contexte.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la maladie étudiée. A travers l’étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d’étudier avec précisions aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. L’étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1360 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 1360 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. 1280 souris vont avoir une injection non douloureuse de piégeurs de fer ou d’inhibiteur d’une molécule régulant le fer ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. C’est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes. 560 souris seront gavées avec un volume adapté avec un geste précis et professionnel durant 5 secondes. Toutes les 2720 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d’une mise à mort réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences associées (immunologie et culture).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les modèles de souris à générer ne présentent aucun phénotype dommageable et sera surveillé et notifié si cas contraire observé. Les interventions sur l’animal sont traduites dans les 3 procédures par des actes induisant une douleur ou une gêne classée comme « légère ». L’injection du fer est une injection uniquegénérant chez la souris une douleur classée « légère ». Les traitements de chélation de fer ou d’inhibition d’hepcidine se font par gavage ou injection intrapéritonéale induisent chez la souris une douleur ou une gène classée « légère ». En fin d’expérimentation, les souris seront anesthésiées avec un mélange de kétamine 400mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg) -intrapéritonéal avec un matériel approprié est un acte induisant une douleur ou une gêne classée légère.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir etre exploiter et permettre la démonstration de nos hypothèses expérimentales.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui restent issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
2. Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentielles. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l’aide d’un logiciel de statistique performant.
3. Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un personnel compétent et habitué. Le gavage des animaux est un geste difficile qui est réalisé par un personnel formé et entrainé. Le comportement des souris sera évalué quotidiennement par un personnel compétent. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animal. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra la mise à mort de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s’est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborées sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche muté d’intéret est adaptée pour étudier la pathologie et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des âges assez précoces qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie avec ou sans apport en fer. A 2 mois ces animaux ont les 1ers influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation sur les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.