Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-293753)
Après une chirurgie crânienne de quarante-cinq minutes, une partie des souris est hébergée seule, un isolement dont le porteur reconnaît qu’il génère du stress chez une espèce grégaire. 2 294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 814 un niveau modéré. Toutes subissent un prélèvement de queue à sept jours, certaines une prise de sang à l’âge adulte, d’autres des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, seulement décrits comme allant « du moins au plus stressant ». Une des lignées a une espérance de vie raccourcie et la mutation étudiée pourrait faire apparaître des tumeurs, atteintes que le porteur met en regard de la forte homologie du gène avec celui de l’humain et de traits autistiques déjà caractérisés chez la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. Il a été démontré que les défauts de substance blanche du système nerveux central (substance riche en gaines de myéline) sont observés de façon systématique chez des patients atteint du spectre de l’autisme. Ces défauts pourraient être directement liés au défaut de myélinisation (processus de formation de gaine de myéline) engendré par la présence d’une mutation de la protéine kinase que nous appellerons ‘protéine A’ qui a été observée chez certains patients. L’objectif de ce projet est l’étude des effets d’une mutation de la protéine A retrouvée chez des patients atteints du spectre de l’autisme. En effet, une telle mutation rendrait son activité kinase constitutivement active. Une souris porteuse de cette mutation telle qu’elle est retrouvée chez les patients, et porteuse d’un marqueur fluorescent pour visualiser les cellules myélinisantes permettra l’étude (1) des défauts structurels de myélinisation, (2) des autres défauts du cerveau liés à cette mutation (études des neurones et de leur fonction), (3) de la présence ou non de traits autistiques chez la souris (étude du comportement moteur, social et cognitif). L’étude de ce modèle murin nous permettra donc de contribuer à la compréhension de la physiopathologie de l’autisme et de mettre en avant de potentielles futures voies thérapeutiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A terme, l’étude approfondie de la souris porteuse d’une mutation de la protéine A, telle qu’elle est retrouvée chez les patients, permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension de comment le développement des gaines de myéline mène à un comportement autistique. Les résultats de ce projet permettront peut-être d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’ensemble des animaux de cette étude auront un prélèvement unique à 7 jours post-natals afin d’identifier les animaux porteurs de la mutation génétique d’intérêt pour notre projet. Une fois adulte, à 60 jours, 20 de ces souris auront une prise de sang (prélèvement unique conforme aux recommandations, effectué sur animal vigile) afin d’analyser différents paramètres biochimiques d’intérêt chez les sujets autistes. Dans le but de caractériser ce modèle de souris et analyser si elle présente des caractères autistiques, un groupe de souris sera étudié dans des tests comportementaux non-invasifs, effectués du moins au plus stressant, et séparés à minima d’une semaine entre chaque. Les tests seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima une heure. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris). Enfin, afin d’analyser les effets de la mutation sur la fonctionnalité du cerveau des souris, une partie d’entre elles seront opérées sous anesthésie locale et générale, et analgésie avant et après l’opération (une seule chirurgie par animal, durée maximal 45 minutes). Les animaux seront observés quotidiennement en post-opératoire afin d’intervenir au plus vite s’ils présentent des signes de douleur. Les animaux devront être hébergés de façon isolée (si sevrées) après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours) et leur cage sera enrichie en maison en carton et en kraft afin de limiter le stress.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’une des lignées murines présente une espérance de vie raccourcie ainsi qu’un développement accru du cerveau. De plus, la mutation que nous étudions pourrait induire le développement de tumeur au sein de l’organisme. Les prélèvements de sang et d’un fragment de queue pourraient générer un stress et une légère et brève douleur, mais aussi un risque de saignement. Des nuisances liées à l’acte chirurgical pourraient survenir : risques liés à l’anesthésie (hypothermie, risque cardio-respiratoire), saignements et infections, qui seront maitrisés par les bonnes pratiques. Un stress pourra être induit suite à la manipulation des animaux et aux tests comportementaux auxquels ils seront sujets. S’agissant d’animaux grégaires, l’hébergement individuel des animaux générera un stress.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : – soit pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin de réaliser les analyses nécessaires pour répondre à notre question scientifique. – soit à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux – soit à la fin de la période de reproduction prévue.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes mis en culture (donc hors de l’animal). il est essentiel ensuite dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal de la mutation afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l’activité électrique des neurones, (2) d’étudier l’impact de la mutation sur le comportement de la souris.
2. Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (2294) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire
3. Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et neslet, papier craft), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les animaux seront suivis régulièrement par notre équipe (deux fois par semaines) et quotidiennement par la zootechnie. Un vétérinaire est présent sur place afin de conseiller les expérimentateurs sur les soins appropriés à mettre en place, si besoin. Ils seront hébergés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie maintenus dans les références recommandées. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe de cinq souris maximum, avec du coton pour se former un nid et un bâtonnet à ronger). Afin d’évaluer les impacts des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux. Ainsi, les animaux génétiquement modifiés seront observés tous les deux à trois jours (deux fois par semaine) à l’aide d’une grille d’évaluation qui permet de suivre de près toute modification du comportement physique ou alimentaire présupposant une détresse de l’animal. Si une telle détresse est observée, l’avis du vétérinaire sera automatiquement demandé et les soins appropriés seront donnés à l’animal. Toute mise en place de traitement nécessitera l’isolement de l’animal. Ainsi tout animal isolé sera dans une cage enrichie avec du kraft, des bâtonnets de bois et une maison en carton. Si le vétérinaire le conseille, l’animal en détresse pourra être euthanasié afin de réduire ses souffrances.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. De plus, de nombreux traits autistiques ont été bien caractérisés chez la souris, avec les tests comportementaux adaptés pour les étudier. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris à différents âges post-nataux correspondant à la maturation de la myéline dans les zones testées. Ainsi par exemple, le comportement social sera évalué à un stade où la myélinisation des cortex gérant les interactions sociales est fortement active.