Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/12/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-032774)
Perte de poids, dégradation de l’état général et perte de mobilité déclenchent la mise à mort avant le terme prévu. 3 255 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules leucémiques humaines directement dans le tibia sous anesthésie, puis des traitements oraux, intrapéritonéaux ou intraveineux quotidiens ou bi-quotidiens, et des prélèvements de sang à la patte sur animal vigile atteignant 15 % de son volume sanguin sur 28 jours, pendant 60 à 120 jours d’étude. L’établissement présente ce modèle comme un outil à intégrer dans son processus de sélection de candidats médicaments, plus fidèle que la greffe sous la peau qu’il reconnaît pourtant moins invasive.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La leucémie aiguë myéloïde (LAM ou AML en anglais) est un cancer hématologique relativement rare dont le besoin thérapeutique reste important. Elle représente environ 1,2 % de l’ensemble des cancers diagnostiqués chaque année dans le monde. L’AML est une pathologie agressive qui se développe rapidement et nécessite une prise en charge rapide. Le pronostic des patients atteints d’AML reste sombre malgré les progrès réalisés ces dernières années. Le taux de survie globale à 5 ans pour l’AML est d’environ 25 % chez les adultes, mais il chute considérablement avec l’âge, atteignant moins de 10 % chez les patients de plus de 65 ans. L’AML peut également toucher les enfants, elle représente 15 à 20% des leucémies pédiatriques. L’arsenal thérapeutique contre l’AML se compose principalement de la chimiothérapie intensive, des thérapies ciblées pour certaines mutations, et de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, ces traitements présentent des limites importantes : une toxicité élevée, une résistance des tumeurs aux thérapies ciblées et surtout des options limitées pour les rechutes. Les AML se développent au sein de la moelle osseuse, puis se disséminent dans le système sanguin ou lymphatique. C’est dans cet environnement propice à la croissance et à la différenciation des cellules sanguines que les cancers des cellules hématopoïétiques prennent leur origine et se développent en premier. L’objectif de ce projet consiste à mettre en place et à intégrer dans nos études sur la souris immunodéprimée (sans système immunitaire, permettant la greffe de tumeur humaine), la greffe orthotopique (qui est située à son emplacement anatomique habituel) des leucémies, via une injection de cellules tumorales dans l’espace intra-tibial, l’un des sièges de la moelle osseuse qui présente l’intérêt d’être facile d’accès. Ce modèle présente un intérêt particulier pour l’étude de la pathologie humaine. En effet, il y a une diffusion des cellules tumorales dans le système sanguin avec pour résultante le développement de signes cliniques similaires à ceux rencontrés chez le patient. Cette approche vise à mieux reproduire les conditions de développement pathologique chez le patient, rendant ainsi les observations et les conclusions obtenues chez la souris plus pertinentes pour les futures applications cliniques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Actuellement, parmi les modèles de recherche préclinique utilisés pour étudier les cancers, l’évaluation de l’efficacité et de la pharmacodynamie (vérification de l’atteinte de la cible thérapeutique) des thérapies candidates s’effectue sur des cellules tumorales greffées sous la peau de la souris avec mesure au pied à coulisse de la taille des tumeurs. Cependant cette approche ne récapitule pas l’ensemble des conditions environnementales et pathologiques des maladies du sang chez l’Homme (telles que la leucémie). Les greffes en intra-veineuse (IV) quant à elles miment la propagation de la maladie chez l’Homme dans le sang ou la lymphe, mais le micro-environnement initial n’est pas le même. Le modèle de greffe intra-tibiale, est quant à lui plus représentatif de la physiopathologie chez le patient. Il permet de sélectionner les futurs candidats médicaments dans un contexte de propagation tumorale qui reproduit plus fidèlement le contexte environnemental et pathologique du patient lors du développement de leucémies. Ce modèle vise à être intégré dans notre processus de sélection et de caractérisation de candidats thérapeutiques dans les pathologies de leucémies en complément de la greffe IV qui reste cependant moins invasive que la greffe intra-tibiale. Le choix de l’un ou l’autre de ces modèles dépendra de nombreux paramètres, tel que l’indication finale d’application du candidat médicament, la question posée ou l’objectif de l’expérience par exemple. En outre, certaines formes de cancer hématologique ne peuvent pas être reproduites chez la souris par greffe sous-cutanée ou intraveineuse, car le microenvironnement n’est pas adapté à leur développement. La greffe intra-tibiale favorise la croissance de ces tumeurs, car elle reproduit le microenvironnement propice à leur développement. Contrairement à la greffe en sous-cutanée qui permet un taux de prise de la greffe oscillant entre 70% et 90%, la greffe intra-tibiale permet un taux de prise proche de 100% ainsi que des tumeurs plus homogènes (selon sources bibliographiques). Ce modèle nous permettra donc d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments pour le traitement de l’AML.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Analgésie préalable à la greffe : injection sous cutanée 20 à 30 minutes avant la greffe (10 secondes/souris) – Greffe intra-tibiale pour l’implantation des cellules tumorales : cette procédure prendra moins de 5 minutes et sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes. – Prélèvements de sang au niveau des membres inférieurs sur animal vigile, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de l’envahissement tumoral ou le suivi pharmacocinétique) (environ 20 secondes par prélèvement par souris). Réitération toutes les 3 semaines. – Traitements sur animal vigile : administrations aigues orales, intra-péritonéales ou intra-veineuses de candidats médicaments (10 à 15 secondes par souris). Traitements sur plusieurs semaines, en quotidien ou bi-quotidien. Dans le respect des limites éthiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans de rares cas, gonflement ou hématome au niveau du genou, provoquant une douleur modérée. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la patte doivent être effectués une fois par semaine et ce toutes les 3 semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation (60 jours s’il n’y a pas d’envahissement tumoral ou 120 jours lors des études d’efficacité avec des candidats médicaments qui provoquent la disparition des cellules tumorales) : – Piqûre au niveau de la veine saphène et prélèvement du sang qui provoque une douleur légère. Ce geste dure au maximum 1 minute par animal. L’envahissement tumoral des leucémies dans la moelle osseuse et dans le sang peut provoquer une perte de poids ainsi que l’apparition de divers signes cliniques : détériorations de l’état général et altération de la mobilité.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Chaque animal sera euthanasié en fin d’étude (ou cours d’étude en cas d’apparition de signes cliniques limites) pour réalisation d’études post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de ne sélectionner que les molécules les plus efficaces en amont des études in vivo. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et c’est encore plus complexe pour des maladies du sang. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. La greffe intra-tibiale représente un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement des AMLs puisque ce modèle se développe dans le tissu d’origine, qu’il récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre les cellules tumorales et leur micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a pas de méthode substitutive. De plus, le modèle sera utilisé dans des phases avancées de développement des candidats médicaments, lorsque l’on se rapproche des phases cliniques chez le patient. Il visera à évaluer un nombre restreint de candidats médicaments dans ce modèle complexe et translationnel.
2. Réduction
Un des intérêts majeurs dans la mise en place de cette approche expérimentale, en plus du fait qu’elle reproduise très finement la complexité environnementale du contexte pathologique qui existe chez le patient, est qu’elle permet un taux de réussite de greffe chez la souris proche de 100%, soit la quasi-totalité des souris greffées qui pourront être incluses dans les études. Les candidats médicaments testés dans ce projet sont issus d’une présélection drastique in silico et in vitro incluant de nombreux modèles substitutifs à l’utilisation de l’animal. Les candidats médicaments sont également évalués en amont pour les aspects de sécurité non clinique et pour définir des doses non toxiques à administrer aux souris. Selon les besoins, une évaluation pharmacocinétique (permettant d’apprécier la distribution des candidats médicaments dans le système sanguin) sera intégrée au sein des études d’efficacité thérapeutique, permettant ainsi de ne pas réaliser deux études indépendantes et ainsi réduire le nombre d’animaux. Pour les prélèvements de sang de cette partie pharmacocinétique, la technique de prélèvement à la veine du membre inférieur, sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal, dans le respect des limites physiologiques et des préconisations applicables au bien-être animal. Le nombre d’animaux par groupe pour la première phase dédiée à la détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale est déterminé sur la base bibliographique de chaque lignée tumorale à étudier, et en respect des volumes de sang prélevables recommandés par la SBEA. Des études statistiques pour cette première étape seront focalisées sur la différence entre mâles et femelles. Nous réaliserons ensuite des études statistiques et nous prendrons en compte l’avancement du développement des candidats médicaments afin de réduire le nombre de groupe par étude si possible : une approche statistique basée sur les données de détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale permettra potentiellement d’affiner le nombre d’animaux par groupe ou le nombre de groupe/étude pour l’étude de l’efficacité des composés.
3. Raffinement
• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Un scoring individuel (axé sur l’activité et le comportement en complément des points limites standards et spécifiques au modèle sont mis en place afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance). • Pour des prélèvements de sang, la technique de prélèvement de sang à la veine latérale du membre inférieur, sera privilégiée. Le volume total de prélèvement est conforme aux recommandations de la structure de bien-être animal afin de respecter la volémie physiologique et le bien-être animal. Cette technique est peu invasive. • Pour la greffe en elle-même, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie, protégés de l’hypothermie par l’utilisation de tapis chauffant. Un gel oculaire sera appliqué pour prévenir la sécheresse oculaire et une administration sous cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir la déshydratation. • À la suite de la greffe, il sera nécessaire de comprimer la zone d’injection par des gestes sûrs et acquis auprès d’un expert formateur afin d’éviter les risques de complications post injection. Les candidats médicaments sont également préalablement évalués pour les aspects de sécurité non clinique et les doses administrées dans ce modèle sont déterminées comme non toxiques pour le rongeur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.