Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-728788)
470 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant douze heures sur une grille en cage à métabolisme individuelle et subissant, lors des tests de tolérance au glucose, une piqûre à la queue toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié d’entre elles est ovariectomisée au cours d’une chirurgie de trente minutes pour reproduire une ménopause, puis toutes alternent régime gras et régime standard pour provoquer des variations cycliques de poids. S’y ajoutent des gavages, des mesures de pression artérielle sur souris éveillées, un test d’effort sur tapis de course, des IRM sous anesthésie et, juste avant la mise à mort, un cathétérisme du ventricule gauche. Toutes sont tuées pour prélèvement d’organes, afin d’évaluer chez la souris la finérénone, un médicament qui dispose déjà d’une autorisation de mise sur le marché et dont le porteur indique qu’il limite déjà l’insuffisance cardiaque chez les personnes obèses.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité centrale devient syndrome métabolique si elle est associée à 2 des 4 facteurs de risque suivant : hypertension artérielle, excès de sucre dans le sang, excès de triglycéride dans le sang, diminution de taux sanguin du bon cholestérol. Le syndrome métabolique dont la fréquence augmente de 60% après la ménopause est associé au risque de développer une Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée, forme d’insuffisance cardiaque la plus fréquente chez les femmes, silencieuse au repos mais se révélant lors d’efforts, de fatigue ou de stress. Le pronostic vital est engagé avec un taux de mortalité de 76% dans les cinq années suivant le diagnostic. Surpoids et obésité sont un problème majeur de santé publique et seuls 20% des individus concernés parviennent à une réduction pondérale durable, les autres courant le risque de variations cycliques du poids associées au diabète de type-2, à des fluctuations de pression artérielle, de rythme cardiaque et de filtration rénale, le tout induisant une surmortalité, en particulier chez les femmes. Après une perte de poids, les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé sont assujettis à une mémoire métabolique préjudiciable limitant le recouvrement des fonctions cardiovasculaires, tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans ce contexte, nous nous intéressons à l’aldostérone, hormone produite par les glandes surrénales, et à son récepteur minéralocorticoïde, notamment impliqués dans la régulation de la réabsorption de sel par les reins, du volume sanguin et donc de la pression artérielle. Il est établi que la finerenone, médicament antagoniste de ce récepteur, limite la progression de l’Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée chez les obèses. Nous voulons dorénavant tester si la finerenone administrée à des individus au cours de phases de perte de poids facilite le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire et réduit le risque de rebond d’insuffisance cardiaque en cas de reprise de poids. Nous réaliserons ces traitements chez des souris femelles en condition ou non de ménopause induite par la suppression des ovaires, dans un modèle de 3 cycles successifs de variation de poids : augmentation puis réduction provoquées par un régime riche en graisse (4 semaines par cycle) suivi d’un retour au régime standard (4, 6, 8 semaines pour les cycles successifs).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La mise en place d’un modèle murin robuste pour mimer des variations cycliques de poids chez les femmes dans des conditions de pré ou de post-ménopause permettra de déterminer comment des variations du métabolisme induisent des dysfonctions systémiques, et comment des mécanismes endocrines pathologiques et/ou associés au vieillissement influencent conjointement la progression de ces dysfonctions systémiques métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques, du tissu adipeux, du pancréas (producteur d’insuline et de glucagon) et des glandes surrénales (productrices d’aldostérone et de glucocorticoïdes). De plus, notre modèle préclinique rend possible l’identification de cibles pharmacologiques pour prévenir le risque de complications cardio-métaboliques chez les femmes sujettes à des variations cycliques de poids. En particulier, nous souhaitons prévenir le risque associé à une mémoire métabolique délétère qui se maintient au cours d’une perte de poids chez les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé, mémoire pouvant limiter ou ralentir le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans cet objectif, notre première hypothèse thérapeutique consiste à prévenir les conséquences de cette mémoire métabolique délétère, grâce un traitement par la finerenone, nouvel antagoniste du récepteur minéralocorticoïde, ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché. Nous testerons la possibilité de bénéfices fonctionnels métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques et endocrines après administration de ce médicament au cours des phases de restriction caloriques permettant une perte de poids, ou au cours du troisième cycle complet de variations cycliques de poids. Une approche préclinique faisant usage d’un médicament autorisé chez l’homme renforce notre projet dans sa dimension translationnelle et dans la perspective d’un transfert clinique chez les patientes. Ainsi, les données précliniques issues de ce protocole pourront améliorer l’arsenal thérapeutique proposé aux femmes qui ont des troubles métaboliques et sont à risque de développer une forme d’insuffisance cardiaque majoritaire chez les femmes, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée, dont l’incidence augmente après la ménopause.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La moitié des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ au cours de laquelle les ovaires seront retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Le traitement par la finerenone sera administré par gavage. Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées. Ces mesures durent environ 15 minutes. Des tests de sensibilité au glucose et de tolérance orale au glucose (gavage de glucose ou injection intrapéritonéale d’insuline, suivis du prélèvement d’une goutte de sang à la queue toutes les 15 min pendant 2h) seront réalisés chez des souris vigile. L’analyse de la composition corporelle est effectuée sur souris vigiles. L’étude des artères de résistance et du système périphérique se fera par tomographie en cohérence optique et angiographie rétinienne en microscopie confocale laser. Les souris seront suivies par échocardiographie sous anesthésie au gaz pour mesurer la fraction d’éjection sanguine du ventricule gauche à chaque battement ainsi que le débit cardiaque. La perfusion sanguine du ventricule gauche, via la circulation coronaire et la capacité du cœur à augmenter sa perfusion après injection d’un agent vasodilatateur seront mesurées par IRM sous anesthésie. Des souris vigiles seront soumises à un test d’effort sur tapis de course, pour mesurer si une amélioration fonctionnelle cardiovasculaire se traduit par une meilleure capacité d’exercice. La collecte des urines sera réalisée en cage à métabolisme pour évaluer l’activité rénale. Précédant la mise à mort des souris, le cathétérisme du ventricule gauche sous anesthésie permettra de déterminer la pression intraventriculaire gauche en diastole (relaxation) et systole (contraction) et des paramètres spécifiques de relaxation et de contractilité, uniquement mesurables en hémodynamique invasive. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Douleur post-opératoire après l’ovariectomie. Inconfort au point d’injection durant le test de sensibilité à l’insuline et l’évaluation de l’intégrité microvasculaire dans la rétine. Stress lié à la contention lors de la mesure de la pression artérielle. Stress et inconfort liés à la mise en cage à métabolisme individuelle pendant une nuit (12h00), les souris étant posées sur une grille permettant de collecter les urines au travers. Inconfort ou douleur lors des phases de réveil après anesthésie générale. Ces anesthésies générales suivies d’une phase de réveil concernent les opérations d’ovariectomie, les examens par IRM et la tomographie en cohérence optique de la rétine.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les expériences réalisées in vivo ne peuvent être remplacées par des études in vitro en raison de la complexité de la pathologie (l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée) nécessitant des analyses fonctionnelles et physiopathologiques complexes, en particulier dans le contexte intégratif de comorbidités telles qu’un diabète de type 2, une dysfonction endothéliale, une dysfonction du tissu adipeux, le risque d’une insuffisance rénale ou hépatique, et en présence de remodelages tissulaires et d’une inflammation chronique. Dès lors, l’utilisation d’animaux ne saurait à ce jour être remplacée par des méthodes alternatives.
2. Réduction
L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire à mettre en évidence une différence entre les groupes. Le nombre d’animaux demandé pour tout le protocole est de 470 et correspond à une volonté de ne pas soumettre les animaux à une fréquence trop élevée d’actes expérimentaux qui génèrerait un excès de stress expérimental et un risque accru de souffrance.
3. Raffinement
Pour s’assurer de bonnes conditions de vie des souris, une observation rigoureuse est indispensable. Les souris sont hébergées dans une animalerie conventionnelle à 5 souris/cage, en portoirs ventilés avec accès ad-libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, plus un enrichissement du milieu (plaque de cellulose, tunnel cartonné). Pour le maintien des conditions d’hygiène, le change est réalisé une fois par semaine. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement par les soigneurs et au moins de manière hebdomadaire par le responsable du protocole et/ou ses collaborateurs, pour déceler le moindre signe de souffrance. Le protocole est initié une semaine après l’arrivée des animaux à l’animalerie pour respecter un temps d’adaptation suite au transport. Pour chaque procédure requérant l’usage d’une anesthésie, l’anesthésie est réalisée dans une cage individualisée, avec une humidification régulière des yeux et le maintien de la température corporelle grâce à une lampe chaude, dans un environnement contrôlé et stabilisé Une couverture analgésique sera proposée avant, pendant et après l’induction , avec une évaluation quotidienne la première semaine post-chirurgicale de la douleur, basée sur la « grimace scale de Langford ». Couplé à un suivi de poids régulier, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite, notamment en période post-opératoire et vers la fin de l’étude. Pendant la chirurgie, nous injectons une solution préchauffée à 37°C de sérum physiologique stérile pour maintenir l’hydratation des animaux. En post-opératoire, une injection de glucose est réalisée ainsi qu’un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l’animal à mieux se nourrir. Nous nous engageons à suivre le bien-être animal avec des feuilles de suivi individuelles, avec la « grille d’évaluation des signes cliniques » dont la « grimace scale de Langford » afin d’identifier des individus à risque de souffrance avant que les points limites soient atteints pour pouvoir appliquer la mise à mort planifiée. Pour les procédures réalisées avec des souris vigiles des phases d’habituation progressive au dispositif expérimental sans mesure sont réalisées.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix de l’espèce animale se justifie par une longue expérience du laboratoire concernant les modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, notamment l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée, après administration d’un régime riche en graisse. Nous nous intéressons à l’impact de la ménopause sur le développement de ce type d’insuffisace cardiaque, pour cela nous utilisons des souris femelles, chez lesquelles la ménopause est induite par ablation des ovaires. Les souris ont 7 semaines à leur arrivée. De plus, nous disposons d’une animalerie moderne avec des portoirs ventilés facilitant l’hébergement et favorisant le confort et la sécurité sanitaire des souris. Enfin, nous disposons d’une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et vasculaires, in vivo et ex vivo, chez la souris.