Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/02/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-148828)
Gavées avec les selles de nouveau-nés grands prématurés, 160 femelles gestantes et 640 souriceaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les 800 souris de ce site sont toutes tuées. 384 souriceaux passent 20 tests comportementaux différents entre 6 et 68 jours de vie, dont un test de mémoire visuelle et spatiale de 66 minutes, chaque petit étant séparé de sa mère jusqu’à trente minutes et de sa portée jusqu’à quinze minutes. Les mères sont tuées après le sevrage parce que leur microbiote modifié interdit de les rendre à l’élevage, et les souriceaux en surnombre le sont aussi. Le porteur reconnaît que les souris colonisées ne reflètent pas exactement les interactions entre microbiote et hôte chez l’être humain, et présente pourtant ce modèle comme un système expérimental valide pour relier microbiote précoce et autisme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet se déroulera dans deux établissements distincts, et certains animaux seront transportés de l’établissement utilisateur EU1 vers l’établissement utilisateur EU2 à J25. Le microbiote intestinal, ou l’ensemble des microbes peuplant le tractus digestif, est considéré comme un composant essentiel dans le développement et la physiologie de l’hôte, notamment pour certains organes comme l’intestin et le cerveau. Alors que 11% des naissances dans le monde sont des naissances prématurées, plusieurs études démontrent que le microbiote intestinal est souvent plus immature et moins diversifié chez l’enfant prématuré par rapport à un enfant né à terme, et ce déséquilibre pourrait être un facteur de risque d’un développement cérébral anormal. Une analyse récente du microbiote intestinal de nouveau-nés prématurés âgés d’1 mois a permis d’associer la composition de leur microbiote intestinal avec un développement cérébral normal ou un développement cérébral atypique, bien qu’il n’ait pas encore été prouvé que le microbiote intestinal cause directement ces différences. Dans ce contexte, nous cherchons à comprendre si la composition du microbiote intestinal dans les premiers jours de la vie pourrait être un facteur de risque de l’autisme. Pour cela, nous transférerons des matières fécales de nouveau-nés prématurés, associés soit à un développement cérébral normal, soit à un développement cérébral anormal. Nous observerons ensuite comment ce transfert de matières fécales humaines affecte chez la souris la physiologie et le comportement, de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’avantage majeur de ce projet est de reproduire les effets potentiels d’un microbiote intestinal humain sur la physiologie et la santé d’un modèle vivant. Bien que les souris colonisées avec un microbiote intestinal humain ne soient pas le reflet parfait des interactions microbiote-hôte chez I’être humain, il a été montré que la composition et la diversité du microbiote humain implanté étaient conservés chez la souris colonisée. Ce modèle animal représente donc un système expérimental valide pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau. Dans ce projet, il s’agira d’étudier l’impact potentiel de microbiotes fécaux d’enfants prématurés sur le développement et la fonction du système digestif, du cerveau, et des comportements associés au TSA (Trouble du Spectre autistique) chez la souris colonisée. Nous souhaitons également identifier les mécanismes par lesquels les premiers micro-organismes colonisant le tractus digestif pourraient impacter son propre développement mais aussi celui d’autres organes avec lesquels il communique : les intestins et le cerveau, et si cela constituerait un facteur de risque pour le TSA. En outre, il n’existe pas à notre connaissance de modèle équivalent dans la littérature permettant d’identifier si des microbiotes humains précoces de compositions définies affectent le développement du microbiote lui-même, celui du système digestif, du cerveau et des comportements, et comment cela peut être lié au(x) risque(s) de TSA.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans ce projet, des gavages seront réalisés pendant 1 à 2 minutes maximum chez l’animal vigile. Un gavage sera réalisé sur un maximum de 160 femelles gestante et 640 souriceaux âgés de 22 jours. Par ailleurs, des échantillons de fèces seront prélevés lors du change hebdomadaire à partir de 14 jours de vie pour chaque souris, à raison de 3-4 selles fraîches émises spontanément après placement de l’animal vigile dans un contenant individuel. Chaque prélèvement de selles n’excédera pas 5 minutes. Pour l’ensemble du projet, 8 prélèvements de fèces seront donc prévus au maximum pour chaque souriceau. 384 souriceaux au total, seront soumis à 20 tests comportementaux différents, réalisés entre 6 jours et 68 jours de vie. Plus précisément, le temps cumulé de test par âge sera de : A 6 jours, 5 minutes maximum, dans 4 tests des réflexes moteurs du nouveau-né. A 7 jours, 10 minutes maximum, dans un test de mémoire olfactive. A 18, 30 et 60 jours de vie, 10 minutes maximum dans des tests d’activité locomotrice et de réflexes moteurs. A 19, 31 et 61 jours, 66 minutes maximum, dans un test de mémoire visuelle et spatiale. A 20, 37 et 67 jours, 30 minutes maximum, dans un test évaluant l’anxiété et le comportement répétitif, des traits comportementaux communs à beaucoup de formes de TSA. A 21 jours, 5 minutes maximum, dans un test d’interaction sociale. De 32 à 34 jours de vie et de 62 à 64 jours, 16 minutes maximum, dans un test mesurant la capacité à résoudre un problème. A 38 et 68 jours, 15 minutes maximum, dans un autre test d’interaction sociale, évaluant aussi la mémoire sociale. Ces tests dureront entre 15 secondes et 30 minutes chacun par animal. Pour les tests de comportement avant sevrage, les souriceaux et leur nid seront séparés de la mère pendant 30 minutes maximum. Pour chaque test individuel, un souriceau sera séparé du reste de la portée pendant 15 minutes maximum. Après sevrage, les souriceaux seront séparés de leurs congénères pendant 30 minutes maximum. Enfin, ces tests seront répétés maximum 3 fois au cours du temps entre 6 et 68 jours de vie, à l’exception du test réalisé à 7 jours et celui réalisé à 21 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1, sauf pour 128 souris à 25 jours (moitié mâle, moitié femelle) parmi les 640 souriceaux du projet, transportées de l’EU1 à l’EU2.Le prélèvement de fèces, la mise à mort et le prélèvement d’organes de ces souris s’effectueront à 38 jours de vie dans l’EU2.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Lors des tests comportementaux avant le sevrage, l’ensemble de la portée sera séparé de la mère pendant 30 minutes maximum, ce qui pourrait provoquer un stress chez les souriceaux. Pour chaque essai comportemental individuel, chaque souriceau sera séparé du reste de la portée pendant une période maximale de 15 minutes, ce qui pourrait induire un stress supplémentaire. De plus, des fèces seront prélevés pour chaque souriceau placé dans un contenant individuel lors de la pesée hebdomadaire et un stress pourrait être induit pendant quelques minutes lors de cette pesée. Par ailleurs, un risque de fausse route ou blessure de l’œsophage peut survenir lors du gavage des mères et des petits de 22 jours. Enfin, le transport peut engendrer un stress éventuel.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les mères seront mises à mort après sevrage de leurs souriceaux car leur microbiote a été modifié et ne pourront pas être utilisées dans d’autres projets ni réintégrées dans l’élevage. Pour la même raison, les souriceaux en surnombre qui n’ont pas servis à équilibrer les portées moins nombreuses, seront mis à mort. Les souriceaux inclus dans le projet seront mis à mort pour des prélèvements d’organes d’intérêt.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet consiste à transférer le microbiote fécal d’enfants grands prématurés à des souris. Ce modèle animal permettra de déterminer si le microbiote intestinal a des effets sur la santé, et notamment sur le développement cérébral et le comportement des souris. L’utilisation d’animaux dans ce projet est donc indispensable pour cette étude, car il n’existe pas à ce jour de modèles informatiques ou de méthodes de laboratoire pour répondre à cette question scientifique de manière globale et complète.
2. Réduction
Au préalable, des échantillons de microbiote humain de bébés prématurés auront été sélectionnés selon des critères cliniques spécifiques, liés notamment au développement cérébral de l’enfant, correspondant le mieux à nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, ces expérimentations seront réalisées de manière égale chez la progéniture mâle et la progéniture femelle en utilisant tous les animaux d’une portée, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés du projet. Un test de puissance statistique nous a permis de calculer, à partir de données comportementales précédentes, le nombre minimal d’animaux nécessaires dans le projet. Pour la colonisation avec un échantillon de microbiote humain donné (1 groupe d’animaux), 16 souriceaux par sexe + 8 souriceaux par sexe (servant uniquement de souris inconnues pour les souris testées dans un test d’interaction sociale), seront nécessaires. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
3. Raffinement
Seront ajoutés les éléments suivants dans chaque cage : un tunnel transparent en plastique, des bâtons en bois à ronger, du matériel de nidification et du papier absorbant. Lors des tests comportementaux réalisés avant sevrage, les souriceaux seront séparés de la mère mais seront conservés avec l’ensemble de la portée dans une cage différente pendant la durée de chaque test. Cette cage contiendra de la litière de la cage d’origine ainsi que du matériel de nidification et du papier absorbant déchiqueté par la mère. Après chaque test comportemental, l’ensemble de la portée sera replacé rapidement dans la cage d’origine avec la mère. Lors du change hebdomadaire de la cage, une petite partie de la litière et le nid établi par la mère seront conservés pour éviter tout rejet de la portée. Le bien-être de chaque animal sera surveillé attentivement et régulièrement, et chaque animal sera pesé une fois par semaine. Des points limites adaptés seront mis en place et appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport avec leurs congénères initiaux pour ne pas provoquer un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera ajoutée de la litière propre mais aussi de la litière et le nid établi dans la cage d’origine, des bâtons à ronger et du matériel de nidification et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Ils seront ensuite emmenés jusqu’à l’EU2 dans un véhicule agréé climatisé (40 min de transport) et seront maintenus au repos 2 semaines avant l’euthanasie pour prélèvement d’organes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les modèles animaux les plus utilisés pour étudier l’impact d’un microbiote intestinal complexe humain sur le développement et la santé de l’hôte sont les rongeurs. A l’heure actuelle, la souris est le rongeur le plus utilisé dans le cadre de l’étude des interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau, et permet donc une comparaison fiable par rapport à la littérature actuelle. Plus particulièrement, des souris totalement dépourvues de germes, nées et élevées en conditions stériles, permettront d’étudier l’impact d’un microbiote de prématuré humain sur le développement et la santé des souris. Les souris seront utilisées du stade néonatal (6 jours de vie) jusqu’à l’âge adulte (70 jours) puisque nous souhaitons déterminer si les premiers micro-organismes du microbiote intestinal représentent un facteur de risque déterminant pour le développement cérébral.