Evaluation d’une approche pharmacologique pour contrecarrer les mutations non-sens dans des modèles murins de maladies neuromusculaires

L’objectif global du projet est d’évaluer l’efficacité de molécules pharmacologiques pour la ré-expression de protéines, dans des modèles murins bien caractérisés de maladies neuromusculaires rares. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de traitement pour ces maladies. Des études sont en cours afin de moduler les déficits secondaires liés aux mutations mais il est pertinent de développer une approche permettant de cibler le défaut primaire (l’absence de protéine en raison de la mutation génétique) en permettant la ré-expression de la protéine déficitaire. Les molécules dont nous voulons évaluer l’efficacité in vivo ont déjà démontré, in vitro dans des systèmes rapporteurs et des lignées cellulaires issues de patients, leur efficacité. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet.

Les maladies neuromusculaires sont des maladies héréditaires rares, cliniquement et génétiquement hétérogènes. La dystrophie musculaire de Duchenne est la maladie musculaire la plus commune chez l’enfant (prévalence estimée à 1-9 / 100 000) et les dystrophies liées au déficit en collagène VI sont la seconde forme de dystrophies musculaires congénitales en Europe dont la prévalence exacte est inconnue. Environ 10 pourcent des patients portent des mutations non-sens entraînant entraînant des codons de terminaison de la traduction prématurés (PTC pour premature termination codon), et une absence de synthèse protéique. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif pour ces maladies très invalidantes. Le besoin de développer des stratégies ciblées est donc très fort. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le bénéfice thérapeutique de nouvelles molécules contrecarrant spécifiquement les mutations non-sens, en forçant la synthèse protéique. A long terme, ces molécules pourraient bénéficier à des patients atteints d’autres maladies génétiques causées par des mutations non-sens. Des modèles murins portant des mutations non-sens dans les gènes impliqués dans ces maladies reproduisent de nombreux défauts moléculaires et fonctionnels, et sont donc des modèles parfaitement adaptés pour l’évaluation de cette approche thérapeutique. Le bénéfice attendu est la ré-expression de la protéine ciblée qui sera détectée sur tissus prélevés en post-mortem, et qui devrait améliorer la fonction musculaire.

Les animaux feront l’objet d’injections quotidienne (sur animal vigil car procédure très rapide), sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en tout début de procédure effectué sous anesthésie (durée de l’acte moins de 5min), un autre juste avant l’euthanasie, sous anesthésie (durée de l’acte moins de 5min). Des mesures de la force musculaire seront réalisées la 1ère semaine du traitement et lors de la 3ème semaine, grâce à un test d’agrippement qui consiste simplement à faire agripper une grille par la souris au niveau de ses membres antérieurs ou postérieurs (ou les deux) en appliquant une légère traction pour mesurer la force d’agrippement. Ce test comporte 3 mesures avec une minute de repos (soit une durée de 3-4 minutes environ). Enfin, les animaux feront l’objet d’une procédure de mesure de force de muscles spécifiques des membres postérieurs, nécessitant une intervention chirurgicale sous analgésique et anesthésie profonde et qui sera immédiatement suivie par l’euthanasie des animaux avant leur réveil. La durée de l’acte chirurgical est d’environ 30min par animal.

Certains animaux de cette étude présentent un phénotype dommageable, qui se traduit par une atteinte musculaire lorsqu’elles sont âgées qui n’altère cependant pas la survie des animaux, ni leur mobilité ou fertilité. Elles sont viables, fertiles, et possèdent une longévité normale. Les souris feront l’objet de procédures consistant essentiellement en des étapes d’injections, puis d’un protocole d’évaluation non invasive de la force musculaire (grip strength), et enfin d’un protocole d’évaluation de la fonction musculaire. Les souris pourraient donc ressentir une légère douleur de courte durée au point d’injection/prélèvement et un stress léger lors des manipulations quotidiennes, la pesée hebdomadaire ou les périodes d’adaptation aux différentes techniques. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite et les sites d’injections peuvent s’infecter. Les tests de force musculaire peuvent générer un stress et une fatigue transitoire. Des prélèvements sanguins sont aussi prévus (en vigile ou sous anesthésie) et peuvent induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Par ailleurs, les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Tous les animaux qui entreront dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, dans le cadre de l’évaluation d’approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des tissus cibles. Dans le cas des modèles que nous allons utiliser, nous devons vérifier l’efficacité de notre traitement au niveau des muscles squelettiques, à la fois d’un point de vue de la force musculaire mais aussi grâce à des marqueurs moléculaires et à la réexpression de la protéine d’intérêt. Ces études d’efficacité seront complétées par l’analyse d’un marqueur sanguin couramment utilisé pour vérifier l’état des cellules musculaires.

Des modèles murins, drosophile et/ou poisson-zèbres ont été décrits pour la dystrophie musculaire de Duchenne et d’autres myopathies. L’approche thérapeutique testée cible un type particulier de mutation qui ne sont reproduites que dans des modèles murins. Le premier modèle utilisé présente un phénotype musculaire adapté pour l’évaluation d’approches thérapeutiques car permettant une meilleure évaluation des bénéfices fonctionnels. Ce modèle présente un phénotype dommageable. Le second modèle est le seul modèle disponible présentant une mutation essentielle pour le projet. Ce second modèle ne présente pas de phénotype dommageable. L’utilisation de ces modèles permettra de valider l’approche thérapeutique dans les tissus affectés. Les animaux sont utilisés à 4-6 semaines, stade auquel la croissance musculaire est bien avancée et afin de réaliser sans problème les injections.