Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 30/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-871549)
Biopsie de la queue entre le troisième et le sixième jour de vie, chirurgie d’une heure trente pour implanter des sondes dans le cerveau et un boîtier sous la peau du dos, puis hébergement seul pendant quatre-vingt-dix jours au plus : 1 263 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Après une semaine de récupération, certaines reçoivent vingt-quatre injections en seize jours, puis restent branchées à un système d’enregistrement jusqu’à dix heures par jour pendant deux semaines. Les souris filmées pour détecter leurs crises perdent tout enrichissement bloquant la caméra, maison et matériau de nidification compris, et une partie des lignées modifiées fait des crises tonico-cloniques à partir de trois mois. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur tissu cérébral.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les troubles neurologiques, comme l’épilepsie, sont souvent liés à des problèmes dans l’équilibre des ions dans les neurones, en particulier le chlorure. Un transporteur important joue un rôle clé dans ce processus. Des mutations du gène qui produit cette protéine sont associées à divers troubles, allant de l’autisme à des formes sévères d’épilepsie chez les enfants. Cependant, on ne sait pas encore exactement comment ces mutations provoquent des crises d’épilepsie. Notre projet de recherche cherche à comprendre ces mécanismes en étudiant des souris portant une mutation d’un gène spécifique, avec l’espoir de trouver de nouvelles pistes pour traiter ces maladies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet étudie une mutation d’un gène spécifique, responsable d’une forme grave d’épilepsie chez l’enfant. Les patients ont des crises d’épilepsie dès la première année de vie associée avec un déficit cognitif (problème pour parler, marcher indépendamment). Les crises de ces patients ne répondent pas aux médicaments actuellement disponibles. En comprenant mieux comment cette mutation affecte le fonctionnement des cellules, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour des traitements plus ciblés et personnalisés. La mutation que nous étudions grâce à une nouvelle lignée de souris a été associée avec un syndrome épileptique sévère : l’épilepsie du nourrisson à crises focales migrantes. Les patients atteints ont des crises d’épilepsies fréquentes et non contrôlées par voie médicamenteuse dès la première année de vie avec un délai neurodéveloppemental sévère ou une régression neurodéveloppementale lors de l’apparition des crises. L’identification et la compréhension des mécanismes cellulaires liés à cette mutation à l’origine de ce trouble permettra d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques pour une médecine de précision.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute. Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau et d’un appareil en sous-cutané au niveau du dos (1 fois, durée 1h30). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 90 jours maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, certains animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24 injections maximum (durée inférieure à 1 minute). Ces injections sont faites sur animal vigile. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 2 semaines maximum). Un groupe de souris sera soumis à une chirurgie sous anesthésie pour induire l’expression d’un gène dans leur cerveau par un virus ou un plasmide (45 min), elles seront ensuite euthanasiées selon une procédure adaptée. Un groupe de souris recevront une injection intrapéritonéale (temps de manipulation inférieur à 1 minute) à un stade précis de développement. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les manipulations et contentions nécessaires au cours des procédures pourront générer un stress chez les animaux. Les injections peuvent induire une légère douleur et un inconfort au point d’injection. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer risque d’infection de la cicatrice ainsi qu’une souffrance locale. L’implantation d’électrodes dans le cerveau peut induire une douleur locale pendant 24 à 48 heures post chirurgie et une légère perte de poids. Les souris implantées devront être en hébergement individuel dès la chirurgie et le resteront pendant toute la durée de l’étude, soit une durée totale d’hébergement individuel de 90 jours maximum. S’agissant d’animaux grégaires, cela pourra générer un stress. Les animaux qui seront pris en vidéo pour détecter des crises n’auront pas d’enrichissement qui bloque visuellement la caméra comme une maison rouge ou de la nidification. La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Une partie des animaux génétiquement modifiés sont sujets à des crises tonico-cloniques à partir de trois mois qui peuvent induire une fatigue ou en cas de crises d’un stade élevé (qui n’ont pas été observés chez ces souris) une atonie et une perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue du projet, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever et étudier leur tissu cérébral post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les mutations étudiées ici ont été identifiées chez des patients humains. Nous avons d’abord étudié cette mutation avec des modèles cellulaires avec lesquels nous avons pu observer une diminution de l’expression membranaire. Toutefois, ce modèle ne permet pas de tester des effets cellules-spécifiques de cette mutation au cours du développement ni l’apparition de rhythmopathies ou de crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
2. Réduction
Les expériences antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée d’histologie et de 10 pour une expérience d’électrophysiologie est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20 pour cent. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 1263 animaux dans le cadre de ce projet. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés afin d’avoir une interprétation fiable.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’une maison en plastique sauf lors des enregistrements vidéo. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Tout le long des procédures, nous assurerons une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. Au cours de l’anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Un produit spécifique sera appliqué sur les yeux pour éviter tout dessèchement des cornées. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiées et reçoivent des injections d’analgésiques en pré- et post-opératoire. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d’infection de la cicatrice. La surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et l’analgésie est maintenue sur 48h après l’opération à raison d’une administration par jour. Une grille d’évaluation de l’état des animaux est mise en place comprenant notamment l’évaluation de l’état du poil, la motilité, et le poids de l’animal. Une injection d’analgésique ou l’euthanasie de l’animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Un délai d’une semaine d’acclimatation sera respecté pour les animaux élevés en dehors de l’institut.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’humain. De plus, l’organisation de l’hippocampe et du cortex chez l’adulte est très similaire chez la souris et l’humain (organisation en couches, morphologie…). Nous souhaitons étudier une nouvelle lignée de souris portant une mutation. Au vu des rôles connus de cette protéine et de son expression au cours du développement, nous émettons l’hypothèse que cette mutation pourrait avoir des impacts sur le développement cortical à des stades embryonnaires ou postnataux précoces. Nous allons donc étudier les différences histologiques à des stades embryonnaires et précoce (1 et 4 jours après la naissance). Nous savons aussi que les adultes de cette lignée présentent des crises tonico-cloniques. Nous souhaitons caractériser ces crises ainsi que le décours temporel de leur survenue. Nous étudierons donc également le stade adulte.