Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/07/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-006696)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre système immunitaire met en place des réponses protectrices pour contrer la menace exercée par les agents pathogènes lors d’une infection. Heureusement, ces réponses laissent une mémoire immunologique, une stratégie qui permet à notre organisme de se souvenir des agents pathogènes précédemment rencontrés. Les lymphocytes B mémoires sont un élément essentiel de cette stratégie : en cas de réinfection, ils peuvent se différencier rapidement en cellules plasmatiques sécréteurs d’anticorps et neutraliser l’envahisseur récurrent ou pénétrer à nouveau dans les centres germinaux, jusqu’à un certain point, et diversifier le répertoire des lymphocytes B mémoires. Malgré l’importance des lymphocytes B mémoires dans la lutte contre les expositions récurrentes aux agents pathogènes, la dynamique de ces cellules au niveau des barrières tissulaires, et en particulier dans la muqueuse intestinale, reste mal comprise. L’objectif principal de ce projet est de découvrir la cinétique, le positionnement spatial et la diversité tissulaire des cellules B mémoires dans le tractus gastro-intestinal lors d’une infection par Salmonella et Klebsiella. Dans cette optique, les objectifs spécifiques sont les suivants : 1. Faire la lumière sur la dynamique spatio-temporelle des cellules B à mémoire intestinale dans les compartiments inductifs et effecteurs au cours de l’infection par Salmonella. 2. Découvrir le positionnement spatial des cellules B à mémoire dans les tissus intestinaux à l’aide de techniques d’imagerie de pointe. 3. Identifier les différents programmes génétiques des lymphocytes B mémoires dans un même organe ou dans différents organes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Plusieurs lignes de recherche ont montré que l’immunité des cellules B contre Salmonella est remarquablement différente de celle suscitée contre d’autres agents pathogènes. Dans le cas de Salmonella, les réponses des cellules B se produisent massivement à l’extérieur des follicules de cellules B pendant le premier mois de l’infection. Il est remarquable que cette réponse primaire puisse établir une immunité à long terme composée de cellules productrices d’anticorps et de lymphocytes B mémoires. Alors qu’une étude récente a dévoilé la biologie du compartiment des cellules productrices d’anticorps, la dynamique des lymphocytes B à mémoire intestinale à la suite d’une infection par Salmonella reste inexplorée. Comme la plupart des vaccins humains homologués reposent sur l’induction de lymphocytes à mémoire de longue durée, la compréhension des mécanismes impliqués dans la génération et le maintien des lymphocytes B à mémoire intestinale est d’un intérêt capital pour la conception de vaccins protecteurs contre Salmonella et d’autres infections d’origine bactérienne se trouvant dans les intestins.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Infection oral de Salmonella typhimurium : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) – Infection oral de Klebsiella pneumoniae : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) – Gavage oral de Tamoxifen dans de l’huile de maïs : 168 souris (aux jours 6, 8 et 10) – Prélèvement sanguin avec anesthésie gazeuse : 1134 souris (aux jours 7, 14, 21, 28 et 35). – Genotypage avec biopsie de la queue et marquage des oreilles: 504 souris (252 souris CD23Cre Bcl6 flox/flox et 252 sourisCD19Cre Tgfbrii flox/flox). – Creation d’une lignée de souris transgéniques: 126 souris (souris KO pour la charnière IgA).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous utiliserons des souches de type sauvage pour le nouveau défi. Comme les souris ont déjà généré une mémoire contre les agents pathogènes, nous nous attendons à ce qu’elles soient protégées contre la réinfection. Cependant, comme l’induction de la mémoire peut varier entre les différentes souches de souris transgéniques que nous utiliserons, les souris qui ne sont pas bien protégées peuvent présenter de la diarrhée et une perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (intestin, rate et ganglions lymphatiques mésentériques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d’analyser rapidement des cellules lorsqu’elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d’anticorps.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu’aucune autre approche ne permet d’obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse intestinale lors d’une infection. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu’en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B intestinales et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l’homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d’accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre les microbes intestinales. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient amplement, d’un point de vue éthique, la réalisation d’expériences sur des animaux.
2. Réduction
Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d’animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il serait utile d’utiliser les mêmes souris pour les expériences d’imagerie et de cytométrie de flux, mais cela n’est pas possible dans notre cas. Tout d’abord, les organes lymphatiques ne peuvent pas être coupés au milieu car nous perdons la structure. Deuxièmement, l’intestin héberge un nombre limité de cellules B mémoires, de sorte que nous avons besoin de tout l’intestin pour le passer en cytométrie de flux afin d’obtenir une centaine d’événements dans le compartiment mémoire.
3. Raffinement
L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l’utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous fournirons également des aliments semi-solides aux animaux au cours de l’infection.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies inflammatoires de l’intestin car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 14 semaines seront utilisées.