Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-04-21 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-007768)
852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d’électroporation in utero, les souriceaux une électroporation sous anesthésie par le froid, et la moitié des portées est placée huit jours dans un environnement appauvri en oxygène. Le porteur indique que cette hypoxie provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses, tout en affirmant qu’elles n’entraînent pas de troubles du comportement. Il décrit l’approche in vivo comme « incontournable », les lésions post-hypoxiques dépendant de mécanismes qu’il juge impossibles à reproduire in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Objectifs fondamentaux du projet : 1) fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral; 2) développer de nouvelles approches permettant de promouvoir la régénération du cerveau après une lésion périnatale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Sur un plan fondamental, nos résultats permettront de caractériser le rôle des voies de signalisation morphogéniques (c-à-d les voies impliquées dans le développement du tissu) dans l’induction de quiescence et l’activation des cellules souches neurales du cerveau postnatal. Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale est limitée après la naissance, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. Nos résultats permettront aussi d’évaluer la pertinence d’une manipulation de ces voies de signalisation pour encourager la régénération du cerveau après une lésion précoce.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des femelles gestantes seront soumises à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des femelles et des souriceaux seront soumis à une administration unique de tamoxifène. Des souriceaux seront soumis à une procédure d’électroporation postnatal qui ne nécessite pas de chirurgie, mais qui s’effectue sous cryo-anesthésie. Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour les souris femelles : L’injection de tamoxifène peut entraîner des complications lors de la mise bas, qui sont prévenues par co-injection de progestérone. L’administration se fera par gavage afin d’éviter tout risque d’injection à proximité d’un embryon. L’hypoxie chronique peut entrainer une réduction de la quantité et qualité de lait que produisent les femelles, qui est évitée en échangeant régulièrement les femelles entre les conditions normales et réduites en oxygène. Pour les souriceaux : L’électroporation postnatale implique une anesthésie sur glace. Afin d’éviter toute brulure cutanée, le souriceau est isolé de la glace. L’hypoxie chronique entraîne un retard de croissance transitoire et des lésions cérébrales diffuses, qui n’induisent cependant pas de troubles du comportement spontané des souris élevées en cage.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Afin d’effectuer des analyses permettant d’étudier l’impact des manipulations sur le comportement et le devenir des cellules souches neurales, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour collecter les tissus et effectuer des analyses transcriptomiques ou histologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Une approche in vivo est incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les lésions neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer la complexité des différents micro environnements dans lesquelles les cellules souches neurales transitent et se développent.
2. Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d’expériences publiées. Les portées seront analysées au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus certaines expériences en conditionneront d’autres. Par exemple, si l’électroporation d’une forme inactive d’un récepteur n’induit aucune activation des cellules souches neurales, alors les expériences de knock-out conditionnel de ce récepteur prévues dans la procédure 2 seront abandonnées, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages variés, nous permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissue permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
3. Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (anesthésie et analgésie). Un suivi journalier des animaux post chirurgie ou post hypoxie, permet de déterminer des points limites stricts et spécifiques au projet par le calcul un score d’inconfort à partir duquel l’animal reçoit une injection d’analgésique, un suivi plus fréquent, ou est euthanasié. Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les femelles seront régulièrement échangées entre les cages standards et celles réduites en oxygène, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’architecture du cerveau de la souris est proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, nous avons établi des méthodes d’étude des cellules souches neurales et des progéniteurs de la zone périventriculaire et un modèle de lésion cérébrale périnatale, qui nous assurent que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines. Pour les expériences de manipulations génétiques in utero, des embryons de 15±1 jours seront ciblés. Pour les expériences de manipulations génétiques postnatales, des souriceaux de 2±1 jour seront utilisés. Le choix de ces deux temps d’intervention se fera en fonction de la nature des protéines ciblées, pour permettre une expression maximale au moment de l’hypoxie. Les souriceaux seront placés en condition hypoxique du 3ème jour au 11ème jour après la naissance. Cette période correspond au 3ème semestre de croissance intra-utérin chez l’homme. Ce modèle permet donc de reproduire les périodes d’hypoxie fréquentes observées chez les grands prématurés. Enfin l’administration de molécules thérapeutiques se fera en fin de période hypoxique aux jours 11 et 12, afin de tester leur capacité à régénérer le tissu.