Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/03/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-023346)
Insuffisance rénale, diarrhée, perte de poids, symptômes neurologiques pouvant aller jusqu’à la mort : les atteintes attendues servent à la fois de résultat expérimental et de critère de mise à mort anticipée. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une instillation intra-rectale de shigatoxine ou de lysat bactérien sous anesthésie, puis jusqu’à sept prélèvements de sang à la mandibule. Le porteur affirme que le recours à l’animal est « irremplaçable » pour observer à l’échelle d’un individu les répercussions de la toxine sur les différents organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Certaines souches d’Escherichia coli pathogènes, appelées EHEC (pour E. coli Entérohémorragique) sont responsables d’infection d’origine alimentaires graves, du fait de leur implantation dans le côlon des personnes infectées et de la production d’une toxine, la shigatoxine. Cette toxine est excrétée à la fois sous forme libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires bactériennes. L’activité de la shigatoxine provoque la mort ces cellules hôtes ciblées, à savoir les cellules endothéliales au niveau du rein, du côlon et de l’encéphale, à l’origine de lésions sévères et potentiellement mortelles. Il est à noter que ces infections affectent majoritairement les jeunes enfants. Ces infections sont particulièrement difficiles à traiter car l’utilisation d’antibiotique est contre indiquée car elle entraine une lyse des bactéries et un choc endotoxique avec le relargage massif de la shigatoxine, à l’origine des formes graves de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de (i) comprendre l’impact des modes de sécrétion des shigatoxines (libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires) sur leur activité biologique, (ii) évaluer les médiateurs de la toxicité de la shigatoxine dans les cellules endothéliales et (iii) développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour lutter contre les effets cellulaires de ces toxines. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’importance des vésicules bactériennes contenant des shigatoxines dans la pathogénie des EHEC et d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule contre l’effet des shigatoxines en absence ou en présence de vésicules bactériennes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules extracellulaires dans l’aggravation des infections par des EHEC et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. De plus, les infections par les EHEC sont difficiles à traiter même une fois l’agent infectieux identifié. En effet, le traitement par des antibiotiques entraine un relargage massif des toxines (choc endotoxique) avec une aggravation de l’état de santé du patient. Le traitement antibiotique est donc déconseillé conduisant à une impasse thérapeutique. L’administration de molécules pharmacologiques capables d’inhiber l’activité de la toxine, qui pourrait donc représenter une approche thérapeutique bénéfique en combinaison de traitement par les antibiotiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à une instillation intra-rectale sous anesthésie fixe (injection intra-péritonéale qui prendra quelques minutes) ou gazeuse une seule fois au début de la procédure (durée totale de quelques minutes). Tous les animaux seront soumis à des prélèvements de sang à la mandibule 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse, soit 7 prélèvements maximum (durée totale du prélèvement de 1 minute). Pour les animaux qui seront inclus dans l’étude de test du traitement inhibiteur recevront deux injections sous-cutanées à 10h d’intervalle. L’injection prendra quelques minutes. Tous les animaux recevront une injection intra-péritonéale de réaliser un prélèvement à la veine cave.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’administration de lysat bactérien ou de shigatoxine par voie intra-rectale contenant la shigatoxine reproduit la physiopathologie observée chez l’homme. En effet, la shigatoxine est sécrété par la bactérie dans l’intestin et les cellules qui y sont réceptives sont présente dans la partie la plus distale de celui-ci. L’instillation intra-rectale permet donc d’avoir une dose connue directement en contact avec les cellules cibles. Ces lésions pourraient entrainent une défaillance des fonctions vitales de l’animal, et notamment une insuffisance rénale, de la diarrhée, une perte de poids, des symptômes neurologiques, une dégradation de l’état général pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. C’est pourquoi des points limites seront définis et évalués à partir du suivi clinique des animaux (réalisé 2 fois par jour et des pesées des animaux (réalisée 3 fois par semaine). Ils serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des vésicules extracellulaires bactériennes et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des modèles cellulaires ont permis de mettre en évidence le mode d’action de la shigatoxine sous forme libre et encapsuler dans des vésicules extracellulaires bactériennes et de valider l’efficacité des molécules que l’on souhaite utiliser contre la shigatoxine. Cependant, le recours à l’animal est irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer, au niveau d’un individu, les répercussions de la shigatoxine au niveau global avec les conséquences sur les différents organes et les répercussions cliniques.
2. Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d’estimer de manière optimale le nombre d’animaux requis. L’innocuité et la dose de la molécule à tester a déjà été validée. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Plusieurs paramètres seront analysés et suivis dans le temps sur le même animal tout au long de l’expérimentation et après le sacrifice notamment grâce à des analyses histologiques.
3. Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages avec une taille et un environnement convenant aux respects des besoins des souris. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des enrichissements seront fournis pour permettre aux souris d’exprimer les comportements propres à son espèce. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour l’ensemble des procédures, l’état clinique sera suivi deux fois par jour selon la grille présenté en annexe. La mesure du poids sera effectuée 3 fois par semaine. Cette surveillance servira d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer des points limites. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Lors des instillations transrectales une anesthésie gazeuse ou fixe sera mis en place pour la contention pendant et de la lidocaïne sera ajouté en local pour augmenter l’analgésie. Lors des prélèvements sanguins, une contention chimique sera effectuée pour augmenter le confort de l’expérimentateur et de la souris. Les injections sous-cutanées seront réalisées avec les souris tenues par la peau du cou et l’injection effectuée dans le pli ainsi formé. Au moment de la mise à mort des animaux, les animaux recevront une injection d’un mélange anesthésique suivie d’une prise de sang à la veine cave, suivie d’une dislocation des vertèbres cervicales. L’animal subissant une chirurgie ante mortem, une analgésie supplémentaire sera ajoutée en local pour l’incision de la paroi abdominale. Tous les prélèvements seront réalisés par une personne correctement formée et ayant l’habitude de ce type de prélèvement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La diversité des modèles utilisés dans les infections à Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) des invertébrés comme Caenorhabditis elegans a fourni à la communauté scientifique un grand nombre de modèles animaux permettant d’étudier les différents aspects de l’infection humaine. Néanmoins, les modèles mammifères et parmi eux, le modèle souris est le plus représentatif de la pathophysiologie observée durant une infection. L’utilisation de souris présentant une mutation pour une kinase nous permettra d’évaluer la contribution de cette kinase sur la médiation des effets des shigatoxines notamment dans les cellules endothéliales car ce sont elles qui sont le plus sensible à la toxine. Souris âgées de 6 semaines. L’utilisation de jeunes souris se justifie par le fait que dans un contexte clinique, les personnes les plus sensibles chez lesquelles le développement d’un syndrome hémolytique et urémique (SHU) est le plus fréquent suite à une infection par des EHEC sont les jeunes enfants.