Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 26/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-050757)
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d’une mutation du gène Kcnq2 responsable d’une épilepsie, elles reçoivent dès un à cinq jours de vie des injections de vecteurs dans le cerveau, sous anesthésie par le froid pour les nouveau-nés, puis des ultrasons focalisés déclenchent des crises et des tests de comportement évaluent leur développement, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les crises spontanées peuvent conduire à la mort de l’animal et décrit la séparation précoce d’avec la mère. Il affirme que les cellules isolées ne reproduisent pas un « cerveau entier » et présente cette lignée comme le seul modèle disponible de la maladie.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie chez l’Homme. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises durant les tous premiers mois de vie (avant 3 mois) et est accompagnée d’une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Actuellement, il n’existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle porteuse d’un variant récurrent du gène KCNQ2 qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Nous parlerons d’une souris mutée hétérozygote pour Kcnq2. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester des approches thérapeutiques. Le projet comporte la stabulation d’animaux à phénotype dommageable, leur traitement par injection de vecteurs thérapeutiques et l’évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d’épilepsie et du comportement. Les vecteurs thérapeutiques seront délivrés dans le cerveau de souris mutées hétérozygotes pour Kcnq2 par des injections intracerébrales entre 1 et 5 jours post natal ou par voie veineuse dès 15 jours post-natal. L’injection des vecteurs thérapeutiques dès P15 sera couplée à l’utilisation de la technique de FUS (ultrasons) permettant de faciliter l’entrée des vecteurs dans le cerveau. Nous avons pour objectif d’identifier un traitement qui apportera un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèles devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible. Nous réaliserons des tests de comportement afin d’évaluer le neurodéveloppement de nos souris.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies dans un modèle unique d’encéphalopathie épileptique. Si un vecteur thérapeutique s’avère efficace pour diminuer les crises d’épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d’essai clinique dans l’espèce humaine avec les neuropédiatres collaborateurs de notre équipe.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans ce modèle de souris, les interventions sont : – biopsie auriculaire pour identification et génotypage (maximum 5 minutes)- anesthésie pour réalisation des injections thérapeutiques (maxiumum 20 minutes) – anesthésie pour pose de puce RFID (maximum 20 minutes) – induction des crises d’épilepsie par ultrasons (une seule sois, habituation de 30 minutes et soumission aux ultrasons de maximum 40 s) – des tests de comportement : apprentissage, mémorisation et préférence sociale (selon les tests de comportement, la durée varie entre 1h et plusieurs blocks sur une semaine) – anesthésie profonde terminale (l’injection dure moins de 2 minutes)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans ce modèle de souris, les effets indésirables sont: – crises épileptiques spontanées conduisant à la mort de l’animal – séparation de la mère pour les nouveau-nés et les animaux de 15 jours pour l’injection et l’implantation de la puce pour les P15 – anesthésie sur glace pour les nouveau-nés avant injection et tatouage de la patte et à l’isoflurane chez les animaux de 15 jours avant injection ou implantation de la puce d’identification et avant perfusion terminale – biopsie auriculaire à l’aide d’un biopsy punch pour les animaux de 13 jours – injections thérapeutiques réalisées sous anesthésie- déclenchement des crises d’épilepsie par ultrasons – stress lié aux tests comportementaux – stress lié à la contention pour les injections avant perfusion et euthanasie des animaux de 15 jours
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont conservés pendant la durée de l’expérimentation (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques) puis mis à mort afin de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immunohistologiques et biochimiques (transcriptomiques et protéomiques). D’autres organes tels que le foie seront également prélevés afin de réaliser des contrôles supplémentaires de notre expérimentation et dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l’espèce humaine, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l’Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. L’étude de l’impact d’un traitement par injection de vecteurs thérapeutiques sur les capacités d’apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l’animal vivant.
2. Réduction
Dans le but de permettre l’obtention de résultats significatifs à partir de nos recherches, chaque groupe de souris (traité ou placebo) doit être composé de 12 animaux. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les vecteurs thérapeutiques candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Par ailleurs nous prélevons le maximum d’organes (cerveau, foie, sang) sur la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisé.
3. Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux. Ils sont hébergés, au maximum par 5, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température, la luminosité, l’environnement sonore et l’hygrométrie sont contrôlés. Les animaux sont hébergés dans une pièce avec peu de passage. Une affiche sera positionnée sur la porte indiquant le caractère sensible des souris, en particulier pour l’exposition sonore. Le personnel animalier et les utilisateurs seront formés et s’assureront de ne pas faire de bruit aux alentours des cages. La pièce de stabulation est directement située en face de la pièce d’expérimentation. Le change et le suivi seront réalisés par des personnes sensibilisées à la spécificité de cette lignée. La méthode d’administration du traitement la moins contraignante sera utilisée dans le cadre du respect de la douleur éventuelle et du stress de l’animal. Les crises d’épilepsie spontanées ou induites par les ultrasons durent quelques secondes et induisent généralement le décès de l’animal. Si la crise intervient en présence d’un expérimentateur, une stimulation des pattes et un massage du corps de l’animal permet de le sauver. La mère des nouveau-nés sera conditionnée aux manipulations et exposée aux odeurs qu’elle risque de rencontrer pendant 7 à 10 jours avant la procédure. Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant les injections ou l’implantation de la puce. Pour les animaux nouveau-nés, nous profitons de l’anesthésie pour les identifier avec de l’encre sous une des pattes pour les différencier. Nous ferons le génotypage a posteriori sur prélèvement post-mortem afin de moins perturber les nouveau-nés et la mère. Les animaux de 15 jours injectés seront génotypés par prélèvement d’un morceau d’oreille à 13 jours qui permet de les marquer. Les animaux injectés à un stade ultérieur seront génotypés lors du sevrage. Nous instillerons un anesthésique local sur l’œil injecté et un gel oculaire sur l’autre cornée. La profondeur de l’anesthésie sera attestée par une respiration profonde et régulière, une absence de réflexe de retrait et palpébral chez les souris de 15 jours. Les tests de comportement présentent une phase d’habituation. Nous réalisons une anesthésie profonde ou euthanasie avant tout prélèvement de tissu
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s’agit de mammifères disposant d’un répertoire génétique très similaire à celui de l’espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les injections de vecteurs thérapeutiques seront réalisées à différents stades : 2 groupes entre 1 et 15 jours post natal, deux groupes entre le sevrage et l’âge adulte – 1 à 5 jours post natal: pour un traitement en préventif – 15 jours post natal c’est-à-dire deux semaines avant l’apparition des premières crises – 30 jours post natal au moment des crises spontanées -90 jours post natal afin de voir si une injection tardive permet d’améliorer les capacités cognitives des souris