Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-120994)
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque chez elles une épilepsie chronique du lobe temporal par injections répétées de pilocarpine, ce qui déclenche des crises généralisées, des tremblements et une perte de poids, avec une mortalité attendue d’environ 25 %. Les souris survivantes passent un test d’open field mesurant l’activité locomotrice, subissent une chirurgie intracérébrale pour recevoir un vecteur viral puis un prélèvement sanguin terminal. Il conclut qu’aucun modèle alternatif ne peut remplacer la souris pour tester ces candidats médicaments avant un passage en clinique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de trouble neurologique dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l’épilepsie chronique en réajustant l’équilibre entre excitation et inhibition de l’activité neuronale. Cependant, ces traitements n’agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l’origine provient souvent d’un ou plusieurs gènes défaillants. Le projet a donc pour objectif de tester l’effet de candidats médicaments à base d’AAV sur un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d’ELT observés chez l’humain. Le projet est focalisé sur l’une des structures du lobe temporal, l’hippocampe, qui joue un rôle central dans la génération des crises d’épilepsies et les troubles du comportement associés. Les souris épileptiques chroniques subiront une analyse comportementale à partir d’un test mesurant l’activité locomotrice spontanée. Cela permettra d’évaluer la réponse comportementale des mêmes souris avant et après l’administration de traitement à base d’AAV pour en tester l’efficacité. À la fin du protocole, ces mêmes souris subiront un prélèvement de l’encéphale afin de comparer les effets des candidats médicaments AAV sur les caractéristiques histologiques principales de l’ELT.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements à base de vecteurs viraux sur le modèle rongeur d’épilepsie du lobe temporal en agissant sur l’aspect histologique et les troubles comportementaux associés. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’épilepsie chronique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 interventions distinctes. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris (âge: 7-9 semaines) subissent une série d’injections (4-6) par voie intrapéritonéale (i.p) de plusieurs molécules (i.e. scopolamine, pilocarpine, caféine, diazépam) afin d’induire un état d’épilepsie chronique (durée de l’intervention: 2h30-3h30 environs). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages de manière individuelle pour toute la durée restante du protocole (i.e. 3 mois). Après une période de 2 mois (durée correspondant à la phase de latence ou phase d’épileptogenèse), la seconde intervention consiste à effectuer l’évaluation comportementale des souris, mesurant l’activité locomotrice spontanée à partir du test de l’open field (OF) avant et après traitement (durée d’intervention : 20min environs). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but d’administrer le candidat médicament ou le véhicule au niveau intracérébral sur 4 sites de la zone hippocampique sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) (durée de l’intervention: 1h environs). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) avant prélèvement de l’encéphale sur animaux morts après perfusion intracardiaque.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Un des effets indésirables potentiel est lié à l’administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’induction de l’épilepsie chronique se réalise à partir d’injections répétées en i.p. Pour cela, la souris est disposée de manière isolée dans un cylindre plexiglas transparent durant une période de 2h30-3h30 pouvant générer du stress. L’induction de l’ELT provoque des crises d’épilepsies généralisées s’exprimant par des tremblements neuromusculaires plus ou moins importants et une hyperactivité caractérisée par des bonds et des courses. Une fois l’induction terminée, les souris sont hébergées dans des cages individuelles pour une durée de 6-8 semaines. Durant les 1ers jours post-induction, les animaux sont susceptibles de subir une perte de poids ainsi qu’une diminution temporaire de leur mobilité. Les animaux sont ensuite soumis à une administration intracérébrale d’AAV (sur 4 sites) nécessitant une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour disséquer les tissus cutanés et pour percer l’os crânien réalisée sur un cadre stéréotaxique. La peau du crâne est ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation et un risque retrait du point par l’animal. En fin de protocole, l’animal est de nouveau anesthésié afin de subir un prélèvement sanguin intracardiaque avant d’être sacrifié pour récupérer le cerveau.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de la procédure 1, le protocole se termine par un prélèvement de sang terminal suivi par la mise à mort de l’animal suite à la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale (Kétamine/xylazine (150mg/kg – 15mg/kg) afin de prélever l’encéphale pour analyser la réorganisation synaptique notamment au niveau de l’hippocampe. Ainsi, tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif du projet étant en partie de tester l’efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l’ELT afin d’améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n’est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. in vitro). En effet, les rongeurs sont un excellent outil pour l’analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l’humeur et sensorimotrices), et sont un très bon substrat pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l’occurrence l’épilepsie. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de l’épilepsie du lobe temporal humaine.
2. Réduction
Bien que le modèle d’ELT de souris pilocarpine soit connu pour induire un taux de mortalité important (~50%), le protocole choisi pour ce projet est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant engendrée une forte diminution du taux de mortalité (~25%; Vigier et al., 2021). Cela permet donc d’augmenter du même ordre le taux de réussite d’induction de l’épilepsie et de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l’induction de l’épilepsie chronique, l’évaluation comportementale, les injections intracérébrales (du candidat médicament ou du véhicule) ainsi que les prélèvements de sang et de tissus cérébral. Ceci permet donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire et d’optimiser l’utilisation de chaque souris. Pour ce projet, un lot expérimental inclut au minimum 1) un groupe de souris contrôles traitées avec une solution saline (SHAM) et 2) un groupe de souris traitées avec une dose donnée du composé candidat. Le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données obtenues préalablement par le sponsor en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre (e.g. distance parcourue à l’OF). Une taille d’échantillon de 10 animaux pour chaque condition serait nécessaire pour atteindre une puissance statistique supérieure ou égale à 0,8. Deux animaux supplémentaires sont ajoutés au regard du taux de mortalité avoisinant les 25%. Au total, cela représente donc un lot expérimental de 10 animaux par groupe + 2 animaux de sureté: 12 animaux x 2 conditions = 24 animaux. Un nombre de 6 lots par an sur 5 ans est estimé par rapport au nombre de projets des années antérieures soit 720 animaux (24 animaux x 6 séries x 5 ans). Cependant un à deux groupes pourront être ajoutés à la demande du sponsor afin de moduler les doses du composé candidat. Cela porte donc notre nombre à un total d’animaux d’au maximum 1440 animaux (12 animaux x 4 conditions x 6 séries x 5 ans).
3. Raffinement
Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations selon un score de sévérité (cf. annexe 2). Les animaux sont familiarisés avec les outils de mesures et les nouveaux environnements. Pour l’induction de l’ELT par injection i.p de pilocarpine : – les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. – pour les injections i.p, pour éviter l’inflammation locale, le site d’injection est alterné entre gauche et droite. – le protocole est basé sur une méthodologie raffinée à la base d’une forte diminution de la souffrance des souris. Au cours des sessions : – les souris sont placées de manière individuelle dans des cylindres plexiglas transparents. La pilocarpine générant une hyperactivitée, il est préférable de les disposer ainsi afin d’éviter toutes blessures pour elles-mêmes ou les autres souris. – des critères comportementaux basés sur l’observation de l’animal, dérivée de l’échelle de Racine et adaptée à la souris, permettent d’anticiper le SE (status epilepticus) mais aussi les problèmes cardio-respiratoires de la souris. Suite à l’injection i.p de pilocarpine, si l’animal atteint un score > ou = 4, une injection i.p de caféine (40 mg/kg) est effectuée. Cette dose limite les problèmes respiratoires sans provoquer d’effets néfastes à long terme. Lorsque le SE de la souris atteint une durée d’1h, une injection i.p de diazépam est effectuée pour stopper le SE. À la fin de la procédure d’induction de l’ELT : – les souris sont placées dans des cages individuelles à température constante (20-24°C) avec alternance jour/nuit de 12h00 pour favoriser leur récupération physiologique. – du gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris est disposé dans chaque cage pour 2 jours minimum (avant retour à l’alimentation normale) pour favoriser l’alimentation et la réhydratation. – des injections s.c de NaCl 0,9% sont réalisées pour favoriser la réhydratation. – les animaux sont surveillés dans les 2h après l’induction de l’ELT) puis quotidiennement: en cas de d’atteinte de points limites = à 1, de la buprénorphine (0,05mg/kg; 0,1-0,2ml) est injectée en i.p. – Si un score de points limites est = à 2, ils sont mis à mort. Selon la chirurgie, les souris sont anesthèsiées soit à l’isoflurane (4%-2,5% – mix air/02) soit à la kétamine/xylazine (150-15mg/kg).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris modèles d’épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d’ELT (génération de crises, troubles cognitifs et de l’humeurs) mais reproduisent également des manifestations histologiques de l’ELT (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette maladie humaine. En outre, l’utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la suite du projet pour le sponsor. Des souris de 7-9 semaines (30-45g) sont préférentiellement utilisées car ce groupe d’âge a le taux de survie et de réussite de l’induction de l’épilepsie le plus élevé.