Essais précliniques de traitement de la glycogénose de type 1a par thérapie génique chez la souris

La glycogénose de type 1a est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du glucose (sucre) pour maintenir la glycémie autour de 1 g/L de sang entre 2 repas. La maladie se caractérise par des hypoglycémies sévères rapidement après un repas, ainsi que par l’accumulation de glycogène, polymère de sucre, et de graisses dans le foie. Ainsi, les patients présentent des foies très gros et gras, et développent à long terme des tumeurs hépatiques. A l’exception d’un contrôle nutritionnel très strict limitant les hypoglycémies, il n’existe actuellement aucun traitement curatif. La transplantation hépatique est la seule solution lorsque le développement tumoral est trop important. La thérapie génique consiste à apporter le gène « médicament » (gène sain) dans les cellules du foie grâce à l’utilisation de vecteurs viraux injectés dans la circulation générale. Ces virus délivreront l’ADN aux cellules hôtes ciblées mais ils ne pourront pas se multiplier dans les cellules et donc provoquer une infection virale. Ces vecteurs sont déjà utilisés pour traiter d’autres maladies métaboliques du foie comme l’hémophilie chez l’homme. Des preuves de concept ont mené au développement d’un nouveau vecteur (brevet déposé) qui permet, après une seule injection chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a, de maintenir une glycémie très similaire à celle des souris saines pendant plusieurs mois, même lors de périodes de jeûne, et de rétablir les paramètres métaboliques, en corrigeant les niveaux de glycogène et de graisses du foie. Avant de débuter la phase d’essais cliniques, l’utilisation de ces vecteurs nécessitent une phase de validation préclinique comprenant des études d’efficacité de doses chez des souris malades, des études démontrant une absence de toxicité des vecteurs utilisés, une étude immunologique, et l’assurance qualité de la production des vecteurs en grande quantité. Dans ce projet, nous testerons l’efficacité de différentes doses du vecteur candidat chez des souris atteintes de glycogénose de type 1a. Cette étude sera complétée par l’analyse de vecteurs dont la capside (enveloppe du virus) a été légèrement modifiée afin d’augmenter l’efficacité de la thérapie génique.

A terme, ce projet devrait permettre de définir la dose optimale de vecteur viral adéquate, efficace et non toxique, pour lancer un essai de thérapie génique pour des patients atteints de glycogénose de type 1a

Les souris atteintes de glycogénose de type Ia seront obtenues par transgenèse ce qui nécessite une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours, pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’induction de la pathologie chez les souris transgéniques sera réalisée par un traitement injecté dans le péritoine à l’âge de 3 semaines, pendant 5 jours de suite ; les souris saines recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Pour la thérapie génique, toutes les souris seront injectées dans la veine de la queue avec les vecteurs viraux ou une solution de sérum physiologique (souris « non traitées ») à l’âge de 10 semaines environ. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de quelques minutes (5 minutes maximum). Avant et après traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie) sera réalisée, tous les mois, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue grâce à l’utilisation d’un glucomètre (Dextro). Ce geste est réalisé en quelques secondes. Une prise de sang sera aussi réalisée en veine sub-mandibulaire. Pour cela, les souris sont soumises à une contention de 1 à 2 minutes. Au total ; les souris seront soumises à 10 interventions dont 1 biopsie, 6 injections, et 3 prélèvements de sang. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier le foie pour analyser les taux de glycogène et de graisse.

Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas) et par des atteintes hépatiques menant au développement de tumeurs du foie. Sans contrôle nutritionnel strict, les hypoglycémies peuvent être fatales et mener à la mort. Les souris seront soumises à des jeûnes courts entre 2h30 et 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée grâce à une production de glucose assurée principalement par le foie (dégradation des stocks de glycogène), mais aussi par les reins et l’intestin. Afin d’éviter la mort des animaux atteints de GSDIa et non traités, la maladie a été induite uniquement dans le foie des souris. Ceci permet de limiter les hypoglycémies au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies quelques heures (2-3h) après une prise alimentaire car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucre hépatique. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies. Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs trop basses de sucres mesurées à l’aide du dextro à partir d’une goutte de sang. Il est à noter que les souris femelles sont plus susceptibles de développer des hypoglycémies et le contrôle de leur comportement est renforcé.

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et du foie. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer la correction des cellules du foie et de déterminer les taux de glycogène et de sucre dans le foie. Le nombre de vecteur viral par cellule de foie sera aussi mesuré.

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de glucose par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle de souris atteintes de glycogénose de type 1a uniquement dans le foie n’existe que chez la souris. Ce modèle a l’avantage d’être viable grâce au maintien de la production de glucose par les reins et l’intestin. Les protocoles seront réalisés chez des souris adultes âgées d’un minimum de 2 mois. L’induction de la délétion du gène G6pc1 sera réalisée chez des souris adultes âgées d’un minimum de 6 à 8 semaines. Le traitement des animaux par les vecteurs viraux sera réalisé 6 semaines après l’induction de la pathologie. La mise à mort des animaux sera effectuée 15 jours (procédure 2) ou 6 mois (procédure 3) après l’injection des vecteurs.