Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-180927)
Pour créer et entretenir des lignées de poissons zèbres privés de gènes liés à l’habituation, une forme de mémoire, 8 700 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l’issue. Cent d’entre eux au maximum subissent à deux mois, sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale, seul geste invasif du protocole. Les poissons dépourvus de la double mutation recherchée sont tués aussitôt, les reproducteurs à douze mois pour éviter les signes de vieillissement. Le porteur annonce vouloir démontrer que ces invalidations génétiques n’entraînent aucun mal-être, sans expliquer comment le total de 8 700 individus se rapporte aux cinquante reproducteurs par génération qu’il dit suffisants pour maintenir les lignées.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le poisson zèbre, quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, réagit en changeant de direction. Lorsqu’il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant un type de mémoire connu sous le nom d’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines d’intérêt. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes codant ces protéines d’intérêt seront ciblés et remplacés par un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d’étudier le rôle de ces protéines invalidées sur l’habituation en évitant le prélèvement d’un petit morceau de la nageoire caudale. L’autre objectif sera de montrer que les poissons doublement mutants pour ces gènes ne présentent aucun effet délétère indésirable et donc que l’invalidation de ces gènes n’entraine aucun mal-être chez l’animal alors même qu’ils ont des problèmes d’habituation.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les défauts d’habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l’Homme nous montrent l’importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines qui nous intéressent mais aussi d’éviter de recourir à une biopsie de la nageoire caudale. La création de poissons doublement mutants nous permet de montrer que le bien-être des poissons mutants générés n’est pas impacté.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Seuls 100 poissons âgés de 2 mois issus de la génération 3, subiront le prélèvement d’une partie infime de leur nageoire caudale, sous anesthésie générale, afin de ne garder que les individus porteurs des doubles mutations. Le temps total de réalisation de la biopsie sera de moins de 2 min et il s’agit là du seul geste invasif qu’auront à subir ces poissons-zèbres au cours de leur vie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour l’ensemble des animaux de ce projet (génération et élevage d’individus mutants), il sera évalué en continu si les mutations ainsi créées engendrent des souffrances chez l’animal. Les poissons dés la 2e génération seront issus d’un croisement entre un poisson sélectionné pour sa fluorescence dans les neurones à l’état larvaire avec un poisson de type « sauvage » ne présentatnt pas de fluorescence. Les poissons sélectionnés pour mener le projet le seront sur la base de la présence de fluorescence dans les neurones à l’état larvaire. La réalisation d’une biopsie de la nageoire caudale, effectuée sous anesthésie générale, à l’âge de 2 mois pour certains animaux (100 maximum) peut entrainer des nuisances légères comme un réveil trop long ou une reprise de nage inhabituelle, des lésions suite à la biopsie ou la non repousse de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Les nuisances ou effets indésirables sont extrêmement rares avec ce protocole établi et utilisé en routine.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l’apparition de signes de vieillissement et donc d’impacter le bien-être des animaux. Les animaux ne présentant pas d’intérêt sur le plan génétique (absence de double mutations) seront mis à mort directement.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique nécessairement l’utilisation de modèles animaux vivants. En effet, la complexité des connexions neuronales ne peut-être reproduit in vitro. Le poisson zèbre représente le modèle le plus simple de cerveau nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés sachant que le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités importantes avec celui de l’Homme.
2. Réduction
Une sélection des embryons âgés de moins de 5 jours présentant une fluorescence appropriée dans les neurones permettra de réduire drastiquement le nombre d’individus à élever au delà de 5 jours de développement en ne gardant uniquement que les poissons d’intérêt. Un nombre minimum d’individus est élevé pour maintenir la lignée (50 par génération) et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement réalisés avant 5 jours de développement et donc hors champ réglementaire. Pour le maintien des lignées, une nouvelle génération est réalisée tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre total de générations et donc d’individus. Pour l’étude de l’existence de nuisances chez les double mutants, seul le nombre minimum d’animaux nécessaires au maintien des lignées (soit 100 maximum) subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale.
3. Raffinement
D’après notre expérience précédente, il n’est pas attendu d’effets délétères indésirables chez les poissons-zèbres générés et conservés. Le prélèvement d’un petit morceau de la nageoire caudale sera le seul geste invasif fait sous anesthésie générale sur 100 animaux maximum et une seule fois dans leur vie.A la suite de la réalisation d’un prélèvement de la nageoire caudale, les poissons sont maintenus deux par deux dans un bac, avec un séparateur entre les deux, pour une durée maximale de 24h, afin d’éviter le stress de l’isolement. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière des individus tout au long du projet pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt de souffrances bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les gènes de l’Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fécondation externe, avec des pontes de plus de 100 œufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d’autres modèles tels que la souris et ainsi d’obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence optique des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux en développement, ce qui permet de relier les événements dans les neurones avec le comportement d’apprentissage de l’animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettront de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement/apprentissage (hors cadre réglementaire). Aussi, les reproducteurs seront gardés jusqu’à 12 mois et avant l’apparition de signes de vieilliesse. Pour les individus subissant une biopsie de la nageoire caudale, celle-ci sera réalisée à 2 mois de développement de l’individu. Cet âge permet d’avoir un individu de taille conséquente, de réduire la taille du fragment prélevé et donc la gêne engendrée par cet acte et une régénération optimale de la nageoire ainsi amputée.