Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-195120)
5000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à terme. Chaque poisson subit sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale (fin clip) pour prélever son ADN et le génotyper, puis reste isolé jusqu’à quinze jours. Les individus non retenus sont euthanasiés et ceux conservés comme reproducteurs sont gardés jusqu’à dix-huit mois avant d’être tués à leur tour. Le porteur indique que le travail sur le génome ne peut se faire que sur un « organisme entier » et signale que certaines nouvelles lignées peuvent développer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou un retard de croissance.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’élevage et le maintien de lignées sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Le prélèvement qui est alors pratiqué est ce que l’on appelle le « fin clip ». Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 3 millimètres de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. Lors de création de nouvelles lignées ou de nouveaux croisements entre mutants, dont nous ne connaissons pas encore la résultante phénotypique, les poissons peuvent pour certains avoir un phénotype qui serait qualifié de dommageable. L’impact que l’on peut avoir aux vues des maladies ciblées vont être des impacts sur la reproduction : retard de croissance, mort subite ou anomalies au cours du développement, diminution de la fécondité, anomalies physiques (déformations de la colonne de type scoliose). Une évaluation de ces observations sera faite en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) pour suivre les animaux et éviter toute souffrance. Une évaluation éthique complémentaire sera alors demandée Ne seront prélevés, que les animaux que nous pensons pouvoir élever par la suite sans impact important sur la nage, la capacité à se nourrir et à se reproduire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le prélèvement tissulaire permet d’accéder à de l’ADN en quantité suffisante pour réaliser un génotypage complet ou pour rechercher les séquences génétiques d’intérêt. Ce travail permet de connaître le génome du poisson et de rapprocher ces informations génétiques des signes cliniques, des modifications histologiques et moléculaires étudiés. Ces corrélations vont permettre de mieux appréhender certaines maladies du système nerveux chez l’Homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux ont un prélèvement cutané unique au niveau de la nageoire caudale qui dure moins d’une minute par poisson, inférieur à 3 mm réalisé sous anesthésie, cela nécessite une prise en charge de 3 à 5 minutes par poisson avec la surveillance du réveil. Les poissons demeurent ensuite isolés au plus 15 jours dans des bacs cloisonnés au sein du système commun d’hébergement. Exceptionnellement pour les poissons hébergés dans la pièce de quarantaine, si un prélèvement de ce type doit être réalisé, il suivra le même procédé et l‘isolement aura lieu en dehors du système, dans un aquarium plus petit, dont l’eau sera renouvelée tous les 2 jours après le nourrissage pour en préserver les qualités physico-chimiques.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 3 millimètres va être faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme avant cicatrisation et régénération en 2 semaines. Ils seront maintenus isolés jusqu’à l’obtention des résultats de l’analyse génétique. Cet isolement se fait dans le système pour leur garantir un environnement contrôlé et dure au maximum 15 jours. Si le prélèvement doit avoir lieu en quarantaine, ce qui est très rare, l’isolement se fera en dehors du système avec un changement d’eau tous les 48hrs et au maximum pendant une dizaine de jours. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Si des symptômes en relation avec les manipulations génétiques apparaissaient de manière répétée, nous pourrions avoir l’émergence d’un phénotype dommageable tel que des anomalies au cours du développement (mort prématurée, malformation) ou des signes cliniques visibles une fois le poisson développé (malformations sur la colonne vertébrale (scoliose), des retards de croissance, des absences ou modifications de certaines organes ou fonctions…), ces effets indésirables seront évalués au fur et à mesure des lignées et pourront faire l’objet d’une évaluation éthique complémentaire s’ils semblent s’installer sur une lignée de poisson.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Nous ne conserverons que les animaux avec le patrimoine génétique d’intérêt, les autres seront euthanasiés. Ces poissons seront regroupés en fonction de leur génotype et maintenus en tant que reproducteurs pour obtenir œufs et larves d’intérêt. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 18 mois, puis euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le travail sur le génome corrélé à l’expression clinique (symptômes physiques), histologique et moléculaire (analyses des tissus), ne peut se faire que sur un organisme entier. Le poisson zèbre a 70% de son génome qui est commun à l’Homme d’où l’intérêt de pouvoir l’utiliser comme modèle pour la recherche scientifique. Les modifications génétiques sont bien maitrisées dans ce modèle animal et cela permet d’explorer de nouvelles pistes de recherche, et mettre en lumière de meilleures possibilités de traitement pour les maladies qui impliquent ces parties du génome notamment ici les maladies neurologiques.
2. Réduction
Les poissons génotypés sont les poissons qui sont issus de croisement d’intérêt ou qui ont eu des injections pour modifier leur génome au stade de l’œuf. Nous utilisons un minimum de 10 couples pour maintenir une lignée. Nous entretenons environ 200 lignées. Nous réaliserons ce geste au maximum sur un total de 5000 poissons au cours de ce projet qui doit courir sur 5 ans. En effet le nombre d’œufs par ponte peut être important, mais c’est une espèce qui accuse toujours une perte conséquente d’individus au cours du développement larvaire, et suite aux injections destinées à obtenir les modifications génétiques recherchées. Nous ferons le prélèvement sur les animaux de taille adaptée (corps d’une taille de 2 cm minimum) et qui semblent en apparente bonne santé pour ensuite être destinés à la reproduction. Ces croisements doivent générés des œufs et des larves qui seront inclus dans des recherches sur le développement, le phénotype, le comportement ou encore en imagerie.
3. Raffinement
L’hébergement est fait dans des aquariums de 3.5L (densité de 20 poissons maximum par aquarium) en groupe constitués à partir des connaissances génétiques et contient un sexe ratio si possible à 50-50. L’eau du système est contrôlée et circule de manière automatisée. Des contrôles indépendants de la qualité de l’eau sont réalisés en plus, régulièrement. Les animaux sont nourris plusieurs fois par jour à la fois avec une nourriture sèche et une nourriture vivante, pour que le comportement de prédation puisse s’accomplir. Les cultures, l’eau et les poissons font l’objet d’un contrôle sanitaire tous les 4 mois. Un cycle lumineux est mis en place 14-10 avec un changement progressif (aube et crépuscule). Un enrichissement visuel est prévu sur les paillasses pour limiter l’éblouissement (sticker de graviers). Lors des mises en accouplement des bacs spéciaux, mimant une plage sont utilisés pour favoriser le fraie et la récupération des œufs. De l’enrichissement social est également disponible à l’animalerie, en élevant des poissons sauvages physiquement différents de manière à pouvoir compléter les effectifs pour éviter les animaux isolés et maintenir les animaux au moins par 3 en conservant la possibilité de les reconnaitre facilement. La biopsie de la nageoire a lieu sur des animaux en apparente bonne santé, ayant atteint un développement (environ 3 mois, taille corporelle de 2 cm) qui limite le risque de l’anesthésie. Les gestes sont réalisés dans le calme et par des personnes formées (tutorat et vérification régulière de la pratique). L’utilisation de l’épuisette se fait avec des mouvements tranquilles et respectueux de l’animal pour limiter le stress. Les conditions environnementales sont adaptées à l’espèce et contrôlées par un système automatique. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Toute anomalie est rapidement signalée, prise en charge et tracée. Si un phénotype dommageable émerge au cours du suivi, il sera évalué, et un avis éthique complémentaire sera demandé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le zebrafish a une reproduction rapide et efficace qui se déroule à l’extérieur du corps des animaux adultes (ovipares). Les spermatozoïdes du mâle et les ovules de la femelle sont émis de manière concomitante dans le milieu extérieur pour assurer la fécondation qui conduit à la formation des œufs. Ces œufs, puis l’embryon qui s’y développe, sont transparents ce qui permet un accès très facile à ces cellules pour en modifier le génome lors des premiers stades de développement pour obtenir des animaux génétiquement modifiés (mutants, perte ou gain d’ADN). Ce travail va pouvoir être rapproché de ce qui se passe dans le génome humain lors de certaines maladies impliquant la génétique. Ces modifications vont avoir des conséquences moléculaires, cellulaires, histologiques et anatomiques qui vont pouvoir faire progresser les connaissances et aider à l’émergence de nouvelles pistes pour la recherche médicale. Les animaux seront en général prélevés aux alentours de l’âge de 3 mois (exceptionnellement sur des animaux de 2 mois mais ayant atteint une taille suffisante, autrement dit 2cm de long, nageoires non comprises). Cela nous permet d’avoir trié et conservé à un stade précoce, les animaux qui nous semblent en mesure d’assurer la génération d’œufs et de larves pour permettre les recherches scientifiques. Cet âge assure également une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes.