Etude de la communication cellulaire et moléculaire entre cellules de Leucémies Aiguës Lymphoblastiques T ou B et microenvironnement médullaire humain.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont des cancers du sang dont le pronostic diffère fortement entre les patients jeunes et âgés. L’intensification de la chimiothérapie a amélioré la survie des patients (supérieure à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications possibles résiderait dans l’influence des facteurs physiologiques sur la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Bien que ces cellules se propagent dans de nombreux organes du patient, le tissu d’expansion privilégié reste la moelle osseuse (MO), située dans les cavités osseuses. Or, la MO évolue avec l’âge : pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance, elle s’enrichit avec le vieillissement, la chimiothérapie et/ou l’obésité. Chez la souris, on retrouve une MO riche en adipocytes dès la naissance au sein des vertèbres de la queue. L’injection de cellules de patients LAL à des souris immunodéficientes (ID), qui ne rejettent pas la greffe de cellules humaines, a montré que les cellules leucémiques deviennent « dormantes » et résistantes à la chimiothérapie dans les os riches en adipocytes. Ce modèle a permis d’identifier de nombreux mécanismes de développement et de chimiorésistance des LAL, mais il souffre d’une limite majeure : les molécules produites dans la MO de la souris ne sont pas parfaitement identiques à celles produites chez l’homme. Pour dépasser cette limite, des chercheurs ont créé un modèle d’os humanisés qui permet de recréer une MO majoritairement composée de cellules humaines. Notre projet vise plusieurs objectifs : 1) Mettre en place une MO « humanisée » chez la souris ID avec une composition cellulaire la plus proche possible de celle retrouvée chez les individus humains sains. 2) Explorer les signaux du microenvironnement médullaire qui influence la croissance ou la résistance aux traitements des cellules leucémiques humaines. 3) Reproduire le vieillissement de la MO afin de comprendre les mécanismes à l’origine des rechutes plus fréquentes chez les individus âgés en comparaison aux enfants. 4) Développer, un modèle pré-clinique pertinent pour l’étude des échantillons de patients qui ne greffent pas en souris ID dépourvues de cet environnement osseux humanisé. Ce modèle d’os « humanisée » constituera un atout majeur pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL.

La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est souvent fatale. Comprendre les mécanismes impliqués dans les mécanismes de résistance menant à la rechute est un enjeu majeur en vue d’améliorer la prise en charge de ces patients. Cette meilleure compréhension passe immanquablement par l’utilisation de modèle d’étude de plus en plus pertinents. On compte parmi ces modèles, les cultures in vitro de cellules leucémiques et les modèles animaux (principalement des souris). Les modèles in vitro permettent de répondre à des questions simples, souvent pour confirmer des résultats observés dans des modèles plus complexes (modèles animaux). Seuls les modèles animaux permettent d’étudier l’interaction des cellules leucémiques avec les composants cellulaires et moléculaires retrouvés dans l’os autrement appelé moelle osseuse (MO). L’utilisation de ce modèle humanisé permet d’avoir un environnement humanisé dans lequel se développe les cellules leucémiques du patient. Il s’agit d’une avancée majeure permettant de mieux comprendre le dialogue qui existe entre les cellules leucémiques et celles de leur environnement de la MO. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et a pour but d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’addiction des cellules leucémiques pour des facteurs produits par les cellules de la MO. Il est important de proposer des thérapies innovantes. Actuellement, les traitements proposés sont majoritairement développés pour cibler les cellules cancéreuses. Mais l’ensemble des connaissances démontre que les cellules cancéreuses communiquent avec leur environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, une thérapie innovante doit intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.

En fonction des questions posées, les animaux seront soumis au maximum à : 1- Une injection de cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines sous la peau de la souris. Cet acte est rapide (quelques secondes) et est réalisé sous sédation (532 animaux). Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. 2- Injection d’une hormone en sous-cutanée en vigile (5 secondes), pour 532 animaux, à raison de 5 jours/semaine, pendant un mois. Cette hormone permet de faire maturer les os « humanisés ». 3- Une injection de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines (hCSPH) pour 520 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Toutefois, ce geste nécessite que les souris soient irradiées au préalable pour permettre la reconstitution des cellules sanguines humaines. Acte qui dure 1 à 2 minutes. 4- Une injection de cellules leucémiques de patients pour 365 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. 5- Afin de mimer une MO d’un patient âgé ou obèse, les croquettes classiquement utilisées seront remplacées par des croquettes complémentées d’une molécule connue pour induire la différenciation adipocytaire pendant 13 semaines pour 98 animaux.6- Selon la question posée, certaines souris subiront une injection de molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules hématopoïétiques et leucémiques. Cet acte, de quelques secondes, est effectué sous sédation 48 animaux. 7- Ces mêmes souris recevront d’autres molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle. Les injections seront réalisées sur des souris non-anesthésiées après avoir appliqué un analgésique local. 1 injection tous les jours pendant 5 jours. Le geste d’injection dure quelque secondes (48 animaux). 8- Selon la question posée, un seul prélèvement de moelle osseuse sera effectué dans le fémur des souris sous anesthésie générale et analgésie. Ce geste dure moins de 5 minutes. Avant le réveil un prélèvement sanguin sera également effectué au niveau du site sous-mandibulaire (durée du geste : 2 secondes). Ce double prélèvement sera effectué sur 364 animaux. Le prélèvement sanguin pourra être renouvelé 4 fois à raison d’un prélèvement toutes les 3 semaines pour 48 animaux. Ce prélèvement sanguin s’effectue avec des souris non-endormies.

Notre expérience dans la réalisation de ces protocoles dans le modèle murin, nous permet d’anticiper des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : – L’Implantation de ce modèle humanisés sous la peau des souris peut engendrer une gêne dans leur déplacement. – La mise en place d’une hématopoïèse humaine chez la souris peut engendrer à long terme une anémie de l’animal liée à une chasse de l’hématopoïèse murine. – L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. – La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. – L’induction d’une MO âgée ou d’un patient obèse peut entrainer des effets liés à la prise de poids rapide des souris. Le prélèvement de moelle osseuse, effectué au niveau des fémurs, est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. au niveau des fémursCe geste est douloureux. – La manipulation des souris peut aussi causer stress et angoisse entrainant un affaiblissement.

Dans l’ensemble des procédures, l’euthanasie des animaux aura lieu soit à l’issue de 12 semaines de mise en place de l’hématopoïèse humaine, soit au cours de l’expansion leucémique, soit 1 semaine après la chimiothérapie. Nous euthanasierons les souris afin de suivre et mesurer le développement de la leucémie. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, mini-os) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront caractérisées. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.

Nous utiliserons des souris immunodéficientes pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. La mise en place d’un modèle humanisé permettra d’obtenir un environnement le plus fidèle possible de celui rencontré par les cellules leucémiques chez les patients. Il outrepassera les limites liées aux barrières d’espèces. Cette amélioration significative du modèle permettra d’aborder plus spécifiquement les dialogues inter-cellulaires. Cela conduira vers de nouvelles pistes thérapeutiques pertinentes pour les patients. En outre, il représente une avancée majeure pour les cellules de patients difficiles à amplifier en souris immunodéficientes qui nécessitent probablement un environnement humain. Le modèle de mini-os deviendra, à minima pour ces patients, le modèle préclinique de référence permettant de tester des cibles thérapeutiques impossible à tester in vivo jusqu’à lors. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.