Impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né face à une infection respiratoire virale dans un modèle de primate non-humain.

L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité, dès la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, dans le cas notamment des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe dans les premières années de vie par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, qui regroupe l’ensemble des micro-organismes qui peuplent nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via le lait maternel. Il interagit avec le système immunitaire au travers des composés issus de son métabolisme, les métabolites, et des cytokines produites par les cellules immunitaires. Le microbiote est indispensable au rôle de barrière des muqueuses et pour l’apprentissage de l’immunité locale, en régulant la reconnaissance des espèces pathogènes ou non et en assurant ainsi l’homéostasie locale. La littérature montre qu’une dysbiose perturbe les capacités du système immunitaire à faire face à une infection. Or ce microbiote peut être facilement fragilisé, notamment par l’utilisation d’antibiotiques, pratique courante en pédiatrie. Même s’il se reconstitue, les effets à court et à long terme de cette fragilisation transitoire restent mal compris. Notre hypothèse est que cette perturbation chez le nouveau-né peut-être responsable de la sévérité observée de certaines pathologies respiratoires de la petite enfance. Comprendre le rôle du microbiote paraît donc déterminant pour appréhender ces situations et envisager des stratégies thérapeutiques pertinentes adaptées. Dans ce projet nous nous intéressons à différents virus ayant un profil pathologique propre à l’enfant. C’est le cas du virus respiratoire syncytial (VRS), principal responsable de bronchiolites aigües, et du virus SARS-CoV-2 de la COVID-19, dont les présentations cliniques sont différentes de ce que l’on observe chez l’adulte, pouvant être sévères (infection VRS) ou asymptomatiques (SARS-CoV-2). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né primate non-humain à une infection virale. Nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie, sur des animaux nés par voie basse et allaités. Nous évaluerons des stratégies thérapeutiques basées soit sur la vaccination maternelle, soit sur une intervention néonatale (vaccin ou traitement probiotique).

Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais aussi d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né, période au cours de laquelle se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intact ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par une dysbiose précoce. Et en explorant des stratégies préventives (vaccination maternelle ou néonatale, administration néonatale de probiotiques), pouvoir contrer ces effets le plus précocement possible en l’ajustant aux capacités et aux besoins spécifiques du nouveau-né. Quant aux bénéfices à long terme, notre réseau autour de l’immunité pédiatrique et nos collaborations avec des pédiatres nous permettront également de confirmer et comparer nos résultats à ce que l’on observe chez les enfants en clinique. Les nouveau-nés bénéficieront des résultats obtenus sur le modèle préclinique pour mieux appréhender et idéalement prévenir les effets délétères d’une dysbiose précoce sur la réponse immunitaire à une infection respiratoire ultérieure et éventuellement à d’autres infections ou agressions.

Mères : – Anesthésie : 40 en moyenne. Pour chacune des interventions, durée 30min à 1h – Echographies : 2 à 3 fois avec un intervalle d’un mois entre, 30min par examen – Prélèvement de sang : une fois par semaine pendant huit semaines au cours de la gestation. Ensuite une à deux fois par mois jusqu’au sevrage. Enfin une fois par semaine pendant un mois après le sevrage. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 5min par prélèvement – Ecouvillonnage des muqueuses aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min – Lait maternel : aux mêmes dates, Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min par collecte – Lavage broncho-alvéolaire : sept lavages. Un pendant la gestation, puis six après la naissance avec un intervalle minimum de deux semaines entre. 20min – Ponction de moelle osseuse : cinq ponctions. Quatre ponctions à deux mois d’intervalles jusqu’au sevrage, puis un mois après sevrage. 20min – Vaccination : deux injections au cours de la gestation. 5min Nouveau-nés : – Anesthésie : entre 18 et 30 en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement, entre 15 et 30min – Contention : jusqu’à 12 fois pour certains points rapides (avec sang et écouvillons) jusqu’à 2 mois de vie maximum. – Prélèvement de sang : 2-3 fois/semaine (0-2 mois de vie), puis toutes les deux semaines (2-6 mois), toutes les trois semaines (6-12 mois), tous les mois (1-2 ans) et enfin tous les trois mois (2-3 ans). Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 5min par prélèvement – Ecouvillonnage des muqueuses : compartiments nasal, oropharyngé, salivaire, rectal, anal, vaginal (si femelle) et oculaire, aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 10min – Lavage broncho-alvéolaire : jusqu’à 17 lavages. 20min – Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 ponctions. 20min – Exposition virale : une exposition. 30min – Vaccination : deux injections. 5min – Traitement antibiotique ou probiotique : administration quotidienne pendant une à quatre semaines. 20min – Imagerie in vivo : trois sessions. Moins d’une heure – Euthanasie en fin d’étude

Nous distinguons les effets de l’expérimentation sur le nouveau-né primate non humain des effets liés aux infections et traitements. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. Cela peut se traduire par un impact sur la prise de poids de l’animal en croissance, à savoir une absence de prise de poids voire une perte. Sur certains points précoces, le nouveau-né sera seulement immobilisé pour ne pas risquer le rejet du petit par sa mère lié à des odeurs non reconnues ou une réactivité moindre suite à l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie difficile à gérer chez le nouveau-né. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères. Les pathogènes entraînent chez le nouveau-né des formes asymptomatiques, légères ou modérées, d’après la littérature et notre expérience. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle ou néonatale, de même que l’administration d’antibiotiques, pourront être associés à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec érythème et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Comme il n’est pas possible d’entraîner un nouveau-né à la manipulation pour limiter le stress, une attention toute particulière sera portée aux techniques employées ainsi qu’au matériel utilisé pour être adapté au mieux aux spécificités du nouveau-né, avec du personnel spécifiquement formé et entraîné sur le modèle.

Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés à des âges différents, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en terme de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’Homme pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à des développement in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.