Validation de la valeur diagnostique d’une modification de l’ADN libre circulant dans le contexte de l’Insuffisance Rénale Aiguë chez le rat.

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant dans 10 pour cent des hospitalisations et chez 50 pour cent des patients en réanimation. Un épisode d’IRA est un facteur de risque pour le développement d’une maladie rénale chronique (MRC), qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Lors d’une IRA, différentes structures rénales sont agressées. Les symptômes étant similaires, l’identification de la structure lésée sur le seul tableau clinique est impossible. Connaître l’origine de l’IRA est pourtant nécessaire car cela permet d’orienter le traitement. L’identification de la structure agressée repose aujourd’hui sur l’analyse d’une biopsie rénale, réalisée sous anesthésie locale. C’est un acte invasif qui présente certains risques, comme une hémorragie rénale. De plus, cette biopsie ne peut être répétée pendant des jours consécutifs. Mettre au point une méthode diagnostique permettant d’identifier les cellules lésées et de suivre l’évolution de l’IRA représenterait une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Lors d’une IRA, les cellules agressées vont mourir et libérer leur ADN dans la circulation et/ou l’urine. Cependant, d’autres cellules non-rénales (comme les cellules inflammatoires) libèrent de façon normale et constante leur ADN dans la circulation. Il faut donc trouver un moyen d’identifier spécifiquement l’ADN des cellules rénales. Un de ces moyens est la caractérisation de la méthylation, qui correspond à l’addition d’un groupement méthyl sur l’ADN de façon spécifique à chaque type cellulaire. Ainsi, par exemple, l’ADN d’un type de cellules rénales ne sera pas méthylé de la même façon que celui des cellules inflammatoires ou d’autres cellules rénales. Caractériser la méthylation de l’ADN présent dans le sang et/ou l’urine pourrait donc permettre d’identifier le type de cellules agressées lors d’une IRA à partir d’une simple prise de sang ou de collection d’urine. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons étudier trois modèles d’IRA expérimentaux chez le rat qui ciblent des structures rénales différentes. Nous analyserons la méthylation de l’ADN sanguin et urinaire à différents stades de la maladie et comparerons les résultats avec l’analyse classique de biopsie de rein.

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. Les maladies rénales sont un problème de santé publique. Une personne sur dix est en effet atteinte par une maladie rénale chronique. Une partie importante de ces malades va évoluer vers l’insuffisance rénale terminale, qui est associée à un taux de mortalité élevé. Les seuls traitements de cette insuffisance rénale terminale sont la transplantation et la dialyse, dont le coût est extrêmement élevé (4 milliards par an). Ils représentent le premier budget de la sécurité sociale en France. L’insuffisance rénale aigue est un facteur de risque de maladie rénale chronique. Il est donc absolument essentiel d’améliorer le dépistage et le suivi des patients atteints de cette maladie afin d’optimiser leur prise en charge et réduire le risque d’évolution vers la maladie rénale chronique.

(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale : Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 à 40 minutes. Elle s’accompagne d’injections pour l’analgésie et l’anesthésie. Ce protocole a une durée de 40-55 minutes. Une autre cohorte d’animaux sera répartie en deux groupes distincts, chacun recevant, sous anesthésie, l’administration d’une molécule toxique pour les reins. L’induction de ces deux autres modèles ne dure que 5 minutes. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine par miction spontanée puis, si besoin, avec un léger frottement sur la vessie (3-10 minutes). Une autre partie sera placée en cage métabolique une nuit pour recueillir un volume plus important d’urine. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale au moment de l’euthanasie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Mesure de la fonction rénale : une partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l’animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (4) Tous les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire.

Les nuisances suivantes peuvent être générées. (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Stress lié à passage d’une nuit en cage métabolique : animal en hébergement individuel dans un cage sans litière, sur une grille. (3) Les injections : les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins, soit une prise de poids en raison d’œdèmes, soit une dénutrition. En règle générale, l’induction d’une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l’état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une mise en place d’une analgésie péri opératoire (6) Les complications liées à l’anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l’euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l’utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l’induction d’une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet. La possibilité d’améliorer le diagnostic et le suivi de l’insuffisance rénale aigue représentera un bénéfice important pour la santé humaine.

Tous les animaux (225) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Nous devons en effet prélever des organes (rein, cœur, foie, cerveau) pour des analyses. Ce prélèvement sera réalisé après constatation de l’absence de battements cardio-respiratoires.

La souris et le rat sont des modèles pertinents de maladie rénale. Nous avons choisi d’utiliser le rat plutôt que la souris car un volume important de plasma et d’urine est nécessaire pour obtenir une quantité suffisance d’ADN libre circulant pour l’analyse de la méthylation. Pour toutes les procédures, les rats sont âgés de 9 à 10 semaines car à cet âge, ils ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.