Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-209369)
1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention de 30 minutes en tube avec prélèvements sanguins pour tester la réponse au stress, une chirurgie d’injection d’un virus dans l’hippocampe sous anesthésie, puis un test de nage en labyrinthe aquatique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains individus vieillissants gardent la mémoire et d’autres non, les retombées pour la maladie d’Alzheimer restant renvoyées au long terme. Le porteur conclut qu’une approche intégrée exige l’animal vivant et qu’aucune technique de remplacement n’est possible.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l’âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement. Enfin, le stress est connu pour avoir un fort impact sur le vieillissement des individus, et la réponse au stress est un facteur prédictif de vieillissement cognitif. De plus, la neurogenèse et l’état des astrocytes peuvent tous deux être affectés par un événement stressant (aigu ou chronique). Dès lors, il est important de connaître la réponse au stress des animaux pour pouvoir établir une corrélation avec l’état fonctionnel des astrocytes associés aux nouveaux neurones de l’hippocampe et le vieillissement cognitif des individus (résilients/vulnérables).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d’Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l’augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s’agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l’UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l’altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d’autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l’âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • Test de réponse au stress : Les animaux seront placés 30min dans un tube de contention de façon à induire un stress et 3 prélèvements sanguins seront réalisés, à 3 temps différents (1600 animaux seront concernés). • Injections intra-cérébrales de virus : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (≈1h/animal) qui consiste en une injection de virus dans l’hippocampe, structure cérébrale impliquée dans la mémoire (1600 animaux). • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire (400 animaux). • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Ils passeront au maximum 6min dans l’eau par jour (4 essais consécutifs de 90s maximum), pendant 6 à 15 jours (1400 animaux). • Euthanasie par injection intra-péritonéale d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant suivie d’une perfusion intra-cardiaque de fixateur sur cœur arrêté pour l’étude immunohistochimique (400 animaux). • Anesthésie profonde par injection intra-péritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique suivie d’une perfusion intra-cardiaque de liquide cérébro-spinal artificiel pour l’étude électrophysiologique (1200 animaux).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Comme lors de tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score. Enfin, au sujet de l’isolement, certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l’hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
2. Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu
3. Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies mensuellement par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.