Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-11-02 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-224131)
570 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral modifié est injecté directement sous la rétine des deux yeux sous anesthésie, suivi d’imageries et d’électrorétinogrammes répétés, puis les yeux, le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. L’objectif est de tester si une modification chimique de l’enveloppe du vecteur le dirige mieux vers la rétine. Le porteur affirme que la rétine ne peut être reconstituée « parfaitement in vitro » et retient le rat pour la taille de son œil, plus commode à injecter.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les outils les plus performants pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. L’AAV de serotype 2 (AAV2) est capable d’infecter une large gamme de cellules in vivo chez le mammifère comme les cellules musculaires, les hépatocytes ou les neurones ce qui explique en partie sa popularité. Ce sérotype a d’ailleurs été utilisé en clinique pour le transfert de gène dans le foie notamment dans le premier essai clinique sur hémophilie B. Ces propos optimistes sont néanmoins pondérés par des limites : •Le tropisme très large des AAV qui peut être à l’origine d’une expression du transgène dans d’autres tissus que celui ou ceux où l’expression du transgène est souhaitée. •Il reste nécessaire d’injecter des doses importantes qui peuvent entrainer une immuno-toxicité au détriment de l’effet thérapeutique Ces principaux inconvénients sont à l’origine de ce projet de recherche car nous pensons qu’une modification chimique ciblée, pourrait changer l’adressage des vecteurs vers l’organe d’intérêt, ici la rétine. Ce projet consiste à modifier chimiquement la capside (l’enveloppe) des vecteurs dérivés du Virus Adéno-Associé de type 2 et 8 (AAV2 et AAV8). Il repose sur le couplage à la surface des vecteurs de molécules chimiques ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine ce qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées. Des premiers tests seront effectués sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent s’approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo. Il est également impossible de vérifier la bio-distribution et l’index thérapeutique de ces particules modifiées sur des cellules en culture. L’utilisation du rat est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres in vivo.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet a pour objectif de déterminer l’infectiosité des AAV (virus adéno-associé) modifiés en les injectant chez des rats sains par voie sous-rétinienne. Il repose sur le couplage de molécules chimiques à la surface de la capside d’AAV ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrée et donc le risque de réaction immunitaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
(i) Injection sous-rétinienne, des vecteurs chimiquement modifiés dans les 2 yeux ou en intra-veineuse : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et de quelques minutes pour l’intra-veineuse. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, le jour de l’injection et le jour de l’euthanasie. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats. Durée du geste, 5min environ.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous nous attendons à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne ou intra-veineuse. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront sous anesthésie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie…) sur lesquels s’appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. L’œil du rat étant 5 fois plus gros que l’œil de souris, l’injection sous-rétinienne est plus facile à réaliser chez le rat, avec une distribution du produit plus homogène entre les individus. La taille de l’œil de rat permet également d’avoir suffisamment de matériel pour réaliser les analyses post-mortem.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu’il soit excessif, permettant d’assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses post-mortem et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec une solution saline, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes : marquages immunohistochimiques), des analyses de biologie moléculaire et biochimiques. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression de la GFP, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre le vecteur et une analyse statistique sur les amplitudes en ERG (électrorétinogramme).
3. Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés et une régulation de leur température, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats. L’enrichissement sera renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L’application de critères d’arrêts nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d’une mise à mort prématurés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat est un bon modèle pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large permettant une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats non albinos, ayant une acuité visuelle moins impactée par l’âge ce qui nous semble cohérent pour l’analyse de l’impact de vecteur sur l’intégrité et la structure de la rétine. Les rats seront utilisés à l’âge d’un mois pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.