Évaluation de l’impact des anticorps neutralisants sur le transfert de gène médié par l’AAV chez le primate non-humain.

Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (vecteurs AAV) sont actuellement les candidats-médicaments les plus utilisés dans cadre de traitement des maladies génétiques, par leur capacité à pénétrer dans un organe/tissus et y faire exprimer un gène thérapeutique. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée soit (i) en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l’exposition naturelle de l’homme à certains virus AAV, (ii) de leur efficacité thérapeutique limitée dans certains organes et (iii) du risque d’une concentration importante dans des organes non ciblés. Ces problèmes sont, à ce jour, les principaux défis à relever pour accroître l’efficacité et la sécurité des vecteurs AAV. Afin de surmonter ces limites, plusieurs travaux ont été menée par notre laboratoire et ont aboutis aux résultats suivants : (i) Identification d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique qui cible spécifiquement les muscles, tout en préservant le foie et le cœur, chez des primates non humains. (ii) Développement d’une nouvelle stratégie de thérapie génique pour la maladie de stockage du glycogène de type III (accumulation du glycogène, réserve de sucre, dans les organes tels que le muscle et le foie notamment) par utilisation d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique dans un modèle de souris. (iii) Démonstration de l’efficacité d’une enzyme (endopeptidase), capable par son action spécifique, de diminuer l’immunité préexistante chez des primates non humains, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), permettrait d’obtenir un transfert de gène efficace.

Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles. Ce qui permettrait d’éviter une accumulation du vecteur dans d’autres organe, notamment foie et coeur (ii) Étudier l’efficacité et la sécurité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène). Ce traitement combiné permettrait de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l’administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d’une deuxième injection thérapeutique

Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : – Dans le mois avant l’injection, les 10 animaux auront 2 prélèvements sanguins (J-30 et J-8), sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin de répartir les macaques dans 3 groupes en fonction du niveau de leur immunité préexistante. – Pour le groupe 1 (n=2) : le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction de leur immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) – Pour le groupe 2 (n=4) : Le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction du niveau de l’immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). – Pour le groupe 3 (n=4) : La veille de l’injection (J-1) : un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé par une injection de « l’AAV à capside vide » ou d’une solution saline (contrôle) par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). Le nombre de prises de sang sous anesthésie (entre 15 et 30 min) seront les suivants : à J0 : n= 8 et entre 1 et 30 jours post-injection : n = 5 – A 30 jours post-injection (J30) : un prélèvement sanguin, avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose létale d’anesthésique.

Tous les gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs : (i) administration lente des produits par voie intraveineuse, et (ii) prélèvements sanguins par ponction veineuse. Aucune douleur ni aucun stress physique ou thermique n’est anticipé pendant la procédure ou en post-injection. Dans le but de réduire au maximum le stress des animaux lié à la contention, toutes les manipulations, à l’exception des observations biquotidiennes, seront effectuées sous anesthésie, ainsi qu’une induction de cette dernière par injection intramusculaire sur des primates préalablement isolés dans des cages individuelles. Un jeûne d’une durée maximale de 12 heures, sera mis en place pour tous les animaux avant leur anesthésie, dans le but de prévenir les régurgitations et les fausses routes pendant la procédure. Cependant, il est important de noter que ces injections n’auront aucun impact sur leur consommation alimentaire et hydrique. Les primates seront réintégrés dans leur cage ou volière une fois pleinement réveillés de leur anesthésie afin de réduire au maximum tout stress environnemental. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute potentielle anomalie non phénotypique en post-injection.

Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 1 mois après l’injection du vecteur testé puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post-mortem. L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir des prélèvements de tissus sur lesquels s’appuieront des analyses de biodistribution et d’expression du transgène, ainsi que des analyses histopathologiques et immunohistochimiques

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est espèce dépendante. Les objectifs principaux de ce projet étant : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement I par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), Il est donc indispensable de choisir l’espèce en conséquence. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l’homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle préclinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 10 singes (Macaca fascicularis) femelles (2-3 ans, 2.5-4.5 kg) seront inclus dans l’étude. Par conséquent, les animaux utilisés dans cette étude sont de jeunes adultes ayant leur système immunitaire mature, indispensable pour notre étude.