Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/04/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-230815)
Injectées dans l’abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d’entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l’œil, avant d’être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques « sans compromettre le suivi et l’acquisition des données de recherche », et toutes les souris finissent tuées pour l’analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l’analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l’étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d’une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d’une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d’entretenir la souche mais également assurer l’infection des lots expérimentaux (l’ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L’administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées – les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l’anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l’euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l’infection).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l’ensemble des souris seront euthanasiées
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection
2. Réduction
En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.
3. Raffinement
En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l’acquisition des données de recherche.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).