Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-250039)
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau d’environ 40 minutes, puis une perfusion intracardiaque terminale ou une décapitation sous anesthésie, pour valider des outils d’interférence ARN ciblant une protéine des cellules gliales. Le porteur décrit les suites de la chirurgie cérébrale, saignements, douleur, faiblesse et risque infectieux pendant la cicatrisation. Il présente ce projet pilote comme fournissant des résultats « indispensables » à la publication de travaux ultérieurs sur le contrôle de la balance énergétique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité est définie par une accumulation anormale ou excessive de masse adipeuse qui peut entraîner des conséquences néfastes sur la santé. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est normalement assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une structure localisée dans le tronc cérébral caudal. Le tissu nerveux comporte des neurones et des cellules gliales, ces dernières ayant longtemps été considérées comme apportant un simple soutien nutritif aux neurones. Les neurones du tronc cérébral caudal sont sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme. Un dysfonctionnement de ces neurones n’explique pas totalement la pathogenèse de l’obésité chez l’Homme. Dans ce contexte, il est aujourd’hui admis que les cellules gliales interagissent avec les neurones pour réguler la balance énergétique mais les mécanismes régissant leur communication demeurent largement inconnus. La connexine 43 est une protéine permettant aux cellules gliales de communiquer entre elles et avec les neurones. Notre objectif global est d’évaluer le rôle de la connexine 43 exprimée par les cellules gliales du tronc cérébral caudal dans la balance énergétique chez la souris. Il nous faut pour cela être à même d’inhiber spécifiquement l’expression de cette protéine dans ces cellules gliales chez des souris adultes. La technologie choisie pour cette inhibition est l’interférence ARN, ciblant un gène particulier. Dans le cadre du projet pilote constituant la présente demande d’autorisation, nous avons conçu et fait produire deux vecteurs viraux permettant d’exprimer spécifiquement dans les cellules gliales du tronc cérébral caudal, une protéine fluorescente, ainsi qu’un ARN interférant dirigé contre la connexine 43 ou un ARN inactif. Notre objectif est de valider la capacité de nos outils ARN interférant et leurs vecteurs viraux à réduire sélectivement l’expression de de la connexine 43 dans ces cellules, sur une durée compatible avec l’analyse d’un impact sur la balance énergétique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet pilote a pour but la mise en place d’injections intracérébrales aigues permettant d’induire une réduction de l’expression de la connexine 43 dans les cellules gliales du complexe vagal dorsal du tronc cérébral. Le principal objectif de ce projet est de raffiner la méthodologie et valider les outils que nous utiliserons par la suite pour étudier l’effet d’une réduction de l’expression de la connexine 43 sur la balance énergétique des souris. Cette étude pilote fournira les preuves scientifiques de la validité des outils utilisés, des résultats indispensables pour la publication de l’ensemble de travaux. Nous utiliserons ce protocole pour mieux comprendre l’implication de la communication des cellules gliales sur le maintien de la balance énergétique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les souris incluses dans le projet (36) sont soumises à une chirurgie stéréotaxique sous analgésie et anesthésie (une fois, durée environ 40 minutes) et soit à une perfusion intracardiaque terminale sous analgésie et anesthésie avec un fixateur formolé (12 souris ; durée inférieure à 2 minutes entre la première incision et la mort), soit à une décapitation sous anesthésie (24 souris ; durée inférieure à 1 seconde).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances et effets indésirables attendus sont ceux liés à chirurgie d’injection intracérébrale : saignements per et post-opératoires, douleur post-opératoire, faiblesse transitoire post-opératoire pouvant limiter les capacités d’accès à la nourriture et à l’eau, fragilité durant la phase de cicatrisation avec risque inflammatoire et infectieux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
PROCEDURE 1 : La mise à mort des animaux est requise pour l’analyse histologique permettant de vérifier la bonne expression de nos vecteurs viraux. PROCEDURE 2 : La mise à mort des animaux est requise pour l’analyse de l’expression de la connexine 43 et la détermination des modifications de structure de cette protéine ayant un impact sur son fonctionnement.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.
2. Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 36 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre de paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Ce projet s’inscrit parfaitement dans une démarche de réduction des répétitions inutiles puisqu’il permet d’établir un protocole robuste pour des injections intracérébrales permettant d’induire une réduction de l’expression de la connexine 43 dans les gliales du complexe vagal dorsal. Le protocole sera reproduit dans le prochain projet pour étudier la contribution de la connexine 43 au maintien de la balance énergétique. Les délais de mise à mort ont été choisis par rapport aux données bibliographiques ayant testé les délais post-traitement à partir desquels l’expression de vecteurs viraux est effective. Néanmoins aucune donnée bibliographique n’existe pour le vecteur viral que nous injecterons dans la région cérébrale ciblée. Ces expériences sont donc essentielles.
3. Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont contrôlés visuellement de façon quotidienne et pesés au minimum deux fois par semaine. Toute détection d’une apparence générale et/ou d’un comportement général suspect et/ou d’une perte de poids supérieure à 5% entraine la mesure d’un score de souffrance selon une grille adaptée et des actions correctives adaptées en cas d’atteinte des points limites ou points d’arrêt établis. Toutes les procédures chirurgicales sont accompagnées d’un traitement pharmacologique ayant pour but de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, la détresse ou l’angoisse subie par les animaux. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique, anesthésie locale, anesthésie générale et contrôle stéréotaxique, avec un traitement antiinflammatoire en postopératoire. Par ailleurs dans ce projet, les injections intracérébrales sont réalisées uniquement en unilatéral pour diminuer le temps de chirurgie et la sévérité de la procédure. Un suivi post-opératoire renforcé permet de repérer précocement tout animal en souffrance de sorte à administrer un traitement analgésique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites ou points d’arrêt établis. En fin de projet, la mise à mort des animaux pour l’analyse histologique est réalisée sous analgésie et anesthésie générale. Tout au long du projet, l’hébergement des animaux se fait avec un enrichissement du milieu, dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées et un cycle jour/nuit 12h/12h. Après la chirurgie, les animaux doivent être hébergés dans des cages individuelles pour leur protection. Néanmoins, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’animal le mieux documenté dans la littérature pour le rôle du cerveau dans le contrôle de la balance énergétique. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Ce stade de développement correspond à celui préalablement utilisé pour établir la carte de référence du cerveau de la souris permettant de repérer chaque structure cérébrale par ses coordonnées en trois dimensions. Les souris seront commandées à l’établissement éleveur pour une arrivée à 7 semaines, permettant une semaine d’habituation et d’acclimatation avant les expériences.